Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2000; 9(8):332-335.

 

EHK-215 Bakteriologická diagnostika - vyhodnocení

 

Helena Žemličková, Pavla Urbášková

 

celkové hodnocení identifikací

 

            Celkem byly rozeslány vzorky 107 laboratořím. 107 laboratoří odeslalo výsledek do závěrečného termínu. Za 3 vzorky mohly laboratoře získat maximálně 6 bodů. Bodování bylo provedeno ve stupnici 2, 1, 0 a -1 bod.

 

Graf 1: Celkový výsledek laboratoří v identifikacích ehk-215

 

            Maximálního počtu bodů dosáhlo 86, tj. 80,4% laboratoří. Limit pro úspěšné absolvování byl 4,186 bodů, (aritmetický průměr minus dvě směrodatné odchylky,

tj. 5,664 – (2x0,739) = 4,186). Tohoto limitu dosáhlo 94 laboratoří, 13 laboratoří tento limit nesplnilo.

 

Výsledky u jednotlivých vzorků

 

 

Vzorek 1: Arcanobacterium haemolyticum – edukativní vzorek

 

 

Arcanobacterium haemolyticum je původcem ranných infekcí a přibližně 3% faryngitid, převážně u mladších adolescentů. Vzácně může být tato bakterie izolována jako příčina sepsí, endokarditid a osteomyelitid. A. haemolyticum je nepravidelná, štíhlá, větvící se,  gram- pozitivní koryneformní tyčinka. Vyrůstá na krevním agaru za 24 až 48 hodin ve velmi drobných, 0,1mm - 0,5mm velkých koloniích, obklopených zónou beta hemolýzy. Pro identifikaci slouží především negativní test produkce katalázy a pozitivní reverzní CAMP test se Staphylococcus aureus. A. haemolyticum neredukuje nitráty, nehydrolyzuje eskulin a želatinu, neprodukuje ureázu. Oxiduje glukózu, maltózu, laktózu; může oxidovat sacharózu; neoxiduje xylózu a manózu. API Coryne A. haemolyticum spolehlivě identifikuje. Actinomyces pyogenes, které je také příčinou ranných infekcí, má téměř stejný mikroskopický obraz a velmi podobnou morfologii na krevním agaru, na rozdíl od A. haemolyticum hydrolyzuje želatinu a oxiduje xylózu.

Kmen měl typické vlastnosti. Oxidoval glukózu, maltózu a laktózu; neoxidoval xylózu, manózu a sacharózu. Měl negativní nitráty, eskulin a želatinu. Numerický profil v API Coryne byl 2530360, A. haemolyticum 99,9% ID.

A. haemolyticum bylo zařazeno do EHK-215 jako výukový vzorek. V budoucích sériích EHK může být tento kmen zaslán k identifikaci.

 

Vzorek 2: Hnis z nitrobřišního abscesu.

 

Odpověď: Staphylococcus aureus + Peptostreptococcus anaerobius

 

 

identifikace

 

frekvence

body

procento

Staphylococcus aureus + Peptostreptococcus anaerobius

    72

2

  67,3%

Staphylococcus aureus + Peptostreptococcus species

    23

2

  21,5%

Staphylococcus aureus + Peptostreptococcus parvulus

      1

1

    0,9%

Staphylococcus aureus + Bacteroides species

      1

0

    0,9%

Staphylococcus aureus + Gemella morbillorum

      2

0

    1,9%

Staphylococcus aureus + Prevotella disiens

      1

0

    0,9%

Staphylococcus aureus

 

      6

0

    5,6%

Peptostreptococcus anaerobius

 

      1

0

    0,9%

Celkem

 

  107

 

100%

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok dosáhlo plného počtu bodů 18 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.

 

Vzorek Staphylococcus aureus a Peptostreptococcus anaerobius byl již jednou zasílán v EHK-118. Počet správných odpovědí byl 36,4% a vzorek nebyl hodnocen. V této EHK získalo plný počet bodů 88,8% laboratoří. Oba mikrobi mohou být původci popsaného onemocnění, každý sám o sobě nebo současně. Identifikace S. aureus nečinila laboratořím žádné obtíže a většina laboratoří správně kultivovala vzorek také anaerobně. P. anaerobius patří spolu s P. magnus a P. asaccharolyticus k těm anaerobním gram-pozitivním kokům, které jsou nejčastěji z izolovány z klinického materiálu. Od ostatních anaerobních koků se P. anaerobius liší citlivostí k Na-polyanetholsulfonátu, (SPS). P. asacharolyticus a P. magnus nejsou citlivé k SPS, nefermentují cukry. P. asaccharolyticus je indol pozitivní, P. magnus indol, urea, eskulin negativní. Dvě laboratoře identifikovaly anaerobního koka jako Gemella morbillorum. G. morbillorum je na rozdíl od P. anaerobius aerotolerantní. Bacteroides sp. a Prevotella disiens jsou gram-negativní anaerobní tyčinky.

 

 

 

 

VZOREK 3: Izolát ze stolice od 4-letého dítěte s průjmem s příměsí krve.

Odpověď: Aeromonas hydrophila

Vzorek dále obsahoval: Escherichia coli, Citrobacter freundii

 

 

identifikace

 

frekvence

body

procento

Aeromonas hydrophila

 

  95

  2

  88,8%

Aeromonas species

 

    3

  2

    2,8%

Aeromonas caviae

 

    2

  1

    1,9%

Aeromonas sobria

 

    6

  1

    5,6%

Patogen nenalezen

 

    1

  0

    0,9%

Celkem

 

107

 

100%

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok dosáhlo plného počtu bodů 18 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.

 

Aeromonas hydrophila byla již jednou zařazena v EHK-78 s výsledkem 76,6% správných odpovědí. V tomto kole dosáhlo plného  bodového ohodnocení 91,6% účastníků EHK.

Aeromonády způsobují onemocnění u ryb, studenokrevných a teplokrevných zvířat. U člověka mohou vyvolávat střevní a mimostřevní onemocnění, např. infekce kůže a podkoží. Průjmová onemocnění se vyskytují především u dětí mladších 5-ti let. Průjmy jsou vodnaté, připomínající choleru, případně s příměsí krve. Nejčastěji izolavané druhy jsou A. hydrophila, A. sobria a A. caviae.

Kmen zařazený do EHK-215 je typový kmen A. hydrophila ATCC 7966. Aeromonády jsou oxidáza pozitivní, redukují nitráty, produkují exoenzymy. Zaslaný kmen měl beta hemolýzu na krevním agaru. Byl arginin, lyzin pozitivní, ornitin negativní, (testy odečítány po třech dnech kultivace), hydrolyzoval eskulin, produkoval indol, štěpil glukózu (s plynem), arabinózu, sacharózu, manitol, neštěpil laktózu, inozitol, salicin; numerický profil API NE 7577754, A. hydrophila/caviae 99,9%, NEFERMtest 24 numerický profil 1536235, A. hydrophila 92,8%, (kmen byl v NEFERM testu 24 lyzin-dekarboxyláza negativní, přesto však jako nejpravděpodobnější identifikace dle num. profilu vycházela A. hydrophila). A. caviae je nehemolytická, lyzin-dekarboxyláza negativní, při štěpení glukózy neprodukuje plyn. A. sobria nehydrolyzuje eskulin, neštěpí arabinózu.

 

 

 

 

 

 

 

 

           

Vzorek 4: Izolát z hemokultury od pacienta z JIP.

 

Odpověď: Serratia marcescens 

 

 

identifikace

 

frekvence

body

procento

Serratia marcescens

 

106

  2

    99,1%

Burkholderia cepacia

 

    1

-1

      0,9%

Celkem

 

107

 

  100%

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok dosáhlo plného počtu bodů 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.

 

Požadavek byl označit signifikantního patogena a vyšetřit jeho citlivost k vyžádaným antibiotikům. Vzorek obsahoval kmen, Serratia marcescens WHO 10. Tento kmen je rezistentní ke kolistinu a citlivý k ceftazidimu a ko-trimoxazolu. Ze 107 laboratoří, kterým byl vzorek zaslán, 106 (99.1%) identifikovalo správně S. marcescens, jedna laboratoř určila kmen jako Burkholderia cepacia.  Všech 107 laboratoří označilo správně kmen jako rezistentní ke kolistinu, jako citlivý k ceftazidimu jej správně označilo 104 laboratoří  (97.2%),  ke ko-trimoxazolu 106 laboratoří (99.1%).  Celkové výsledky jsou v tabulce 1, která obsahuje také limitní hodnoty průměrů inhibičních zón (IZ) a minimálních inhibičních koncentrací (MIC) pro citlivé kmeny, výsledky naměřené v NRL pro antibiotika a výsledky laboratoří v kategorii citlivosti a rezistence u kmene č. 4.

 

Tabulka 1. Výsledky vyšetření citlivosti  kmene č. 4  Serratia marcescens WHO 10.

 

Průměry IZ (mm)

MIC (mg/l)

Správné výsledky

Antibiotikum

limit pro

citlivé kmeny G-tyček  [1]

rozmezí naměřené v NRL*

limit pro citlivé kmeny G-tyček

[1]

hodnoty naměřené  v NRL**

kategorie

[1]

počet

laboratoří

 

%

kolistin

>=10

6-6

<=4

32

R

107/107

100.0

ceftazidim

>=18

28-31

<=4

0.25

C

104/107

  97.2

ko-trimoxazol

>=16

26-30

<=32

4

C

106/107

  99.1

* 5 měření diskovou difuzní metodou [1]; obsah disků: kolistin 10 ug, ceftazidim 30 ug, ko-trimoxazol 25 ug.

** 2 měření diluční mikrometodou.

C - citlivý, R - rezistentní [1].

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek testování citlivosti ke kolistinu a kotrimoxazolu 20 laboratoří, k ceftazidimu 19 laboratoří. Výsledky testování citlivosti Serratia marcescens je možno hodnotit.

 

Kmen č.5 je E. coli  CNCTC 5321, kopie kontrolního kmene  E. coli ATCC 35218. Požadavek byl na vyšetření citlivosti ke kombinaci aminopenicilinu s inhibitorem beta-laktamázy, označení použité kombinace, a vyšetření citlivosti cefotaximu. Kmen byl k těmto antibiotikům citlivý. Tabulka 2 obsahuje limitní hodnoty průměrů inhibičních zón (IZ) pro citlivé kmeny gramnegativních tyček, rozmezí IZ kontrolního kmene E. coli ATCC 35218 uváděné NCCLS [2] a naměřené v NRL, interpretaci v kategorii citlivosti a výsledky laboratoří u kmene č. 5.

 

Tabulka 2. Výsledky vyšetření citlivosti kmene č. 5.  E. coli CNCTC 5321.

 

Průměry IZ (mm)

Správné výsledky

Antibiotikum

Limit pro

citlivé kmeny G-T

 [1]

E.coli ATCC 35218

rozmezí uváděné

v NCCLS [2]

E.coli CNCTC 5321 rozmezí naměřené

v NRL*

 

kategorie

[1]

počet

laboratoří

 

%

amoxicilin/klav.kys

>=18

18-22

18-20

C

65/76***

85.5

ampicilin/sulbactam

>=15

13-19

13-14

C

12/19***

63.2

cefotaxim

>=18

N

33-36

C

106/107

99.1

* 5 měření diskovou difuzní metodou [1];  obsah disku: amoxicilin/klav.kys.  20/10 ug, ampicilin/sulbactam 10/10 ug, cefotaxim 30 ug.

** 2 měření diluční mikrometodou.

***  9 laboratoří nespecifikovalo aminopenicilin/inhibitor beta-laktamázy, 6 (75%) z nich uvedlo C.

C - citlivý, R - rezistentní [1], N – neudáno, ATCC-American Type Culture Collection, CNCTC-Czech National Collection of Type Cultures.

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek testování citlivosti ke kolistinu k antibiotikům 20 laboratoří. Výsledky testování citlivosti Escherichia coli je možno hodnotit.

 

Závěr

 

Výsledky u kmenů č. 4 a  5 potvrzují, že laboratoře v ČR nemají  problémy s vyšetřením účinku většiny antibiotik na gramnegativní tyčky. Trvalou výjimkou jsou některé kombinované preparáty, z nichž k vyšetření citlivosti kmene č. 5 byly v EHK 215 zařazeny kombinace aminopenicilinu s inhibitory beta-laktamáz. Kmen č. 5 je E. coli CNCTC 5321, kopie kmene E. coli ATCC 35218, který produkuje beta-laktamázu a je určen  pro kontrolu kvality vyšetřování citlivosti bakterií ke kombinacím beta-laktamových antibiotik s  inhibitory beta-laktamáz (klavulanát, sulbactam, tazobactam). Jak je patrné z tabulky 2, inhibiční zóny kmene E.coli ATCC 35218 kolem disku s kombinací ampicilin/sulbactam, uváděné NCCLS [2], stejně jako rozmezí průměrů inhibičních zón, naměřené v NRL, mohou být menší (13 -14 mm) než je limit pro citlivé kmeny (>=15 mm).  Při interpretaci výsledku diskové difuzní citlivosti je proto nezbytné vždy brát v úvahu 1) referenční rozmezí inhibičních zón daného kontrolního kmene [1, 2]  a 2) vlastní výsledky vnitřní kontroly kvality s tímtéž kontrolním kmenem. Teprve pak lze porovnávat inhibiční zónu naměřenou u vyšetřovaného kmene s limitem pro citlivé kmeny a interpretovat výsledek. Pokud je na příklad inhibiční zóna naměřená u kontrolního kmene 13 mm, čili  v dolním povoleném limitu, a klinický kmen vyšetřený za stejných podmínek vytváří inhibiční zónu rovněž 13 mm, pak se tento kmen pokládá za citlivý k danému antibiotiku bez ohledu na uváděné limitní zóny pro citlivé kmeny (na př. >=15 mm).

 

Výsledky byly, jako obvykle, den po uzávěrce zveřejněny na webových stránkách SZÚ - CEM. Na adrese http://www.szu.cz/cem/ehk/ehk215/EHK-215.htm je možné si prohlédnout fotografie diagnostických půd s kulturami a výsledky diskového testu zjišťování rezistence k antibiotikům.  

 

 

Literatura

 

[1] Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody. Trios; 1998.

[2] National Committee for Clinical Laboratory Standards.   Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Ninth Informational Supplement.  NCCLS document M100-S9, NCCLS, Pennsylvania USA, 1999.

                                                                                                                               MUDr. Helena Žemličková
RNDr. Pavla Urbášková, CSc.

 

MUDr. Helena ŽemliRNDr. Pavla Urbášková, CSc.