Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2001; 10(12):480-483.

 

EHK-269 Bakteriologická diagnostika-vyhodnocení

Helena Žemličková, Daniela Dědičová, Pavla Urbášková

 

celkové hodnocení identifikací

 

            Celkem byly rozeslány vzorky 109 laboratořím. 108 laboratoří odeslalo výsledek do závěrečného termínu. Za 4 vzorky mohly laboratoře získat maximálně 8 bodů. Bodování bylo provedeno ve stupnici 2, 1, 0 a -1 bod.

 

Graf 1: Celkový výsledek laboratoří v identifikacích ehk-269

 

 

            Maximálního počtu bodů dosáhlo 101, tj. 93,5% laboratoří. Limit pro úspěšné absolvování byl 5,818 bodů, (aritmetický průměr minus dvě směrodatné odchylky,

tj. 7,778 – (2 x 0,980) = 5,818). Tohoto limitu dosáhlo 106 laboratoří, 2 laboratoře tento limit nesplnily.

 

Výsledky u jednotlivých vzorků

Vzorek 1: Výtěr z cervixu při podezření na cervicitidu.

 

Odpověď: Neisseria gonorrhoeae

Vzorek dále obsahoval: Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum

 

identifikace

 

frekvence

body

procento

Neisseria gonorrhoeae

 

  103

2

   95,4%

Enterococcus faecalis

 

      3

   0

     2,8%

Enterococcus faecalis, Lactobacillus sp.

 

      2

   0

     1,9%

Celkem

 

  108

 

  100%

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.

Identifikace gonokoka nečinila laboratořím žádné obtíže. Z celkového počtu 108 zúčastněných laboratoří neizolovaly Neisseria gonorrhoeae pouze 3 laboratoře. N. gonorrhoeae je typickým původcem cervicitidy a uretritidy u mužů. Diagnostické problémy může činit faryngeální forma kapavky, která je při běžném zpracování vzorku výtěru z krku neprokazatelná. Narůstající rezistence k antibiotikům představuje problém v terapii kapavky. Vysoká prevalence rezistence k penicilinu a tetracyklinu byla již dříve popsána v jižní Asii a v Africe. V posledních narůstá rezistence k chinolonovým antibiotikům. V Japonsku v letech 1997-98 byla téměř čtvrtina (24,4%) gonokoků rezistentní k ciprofloxacinu[1], v Řecku mělo v roce 1999 sníženou citlivost k chinolonům 11,8% izolátů[2]. Výskyt epidemií způsobených kmeny se sníženou citlivostí k chinolonů byl popsán v Řecku, Velké Británii, USA, Kanadě a Austrálii. Tento jev je vysvětlován změnou epidemiologie gonokoků (vyšší přenos, delší infekčnost) a extenzivním užíváním chinolonových antibiotik[2].

 

Literatura

 

[1] Tanaka M, Nakayama H, et al. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae and high prevalence of ciprofloxacin-resistant isolates in Japan, 1993 to 1998. J Clin Microb 2000;38(2):521-525.

[2] Mavroidi A, Tzouvelekis LS, et al. Characterization of Neisseria gonorrhoeae strains with decreased susceptibility to fluoroquinolones isolated in Greece from 1996 to 1999. J Clin Microb 2000;38(9):3489-3491.

 

 

Vzorek 2: Výtěr z oka od pacienta s konjuktivitidou.

 

Odpověď: Moraxella (Branhamella) catarrhalis

Vzorek dále obsahoval: Staphylococcus epidermidis

 

identifikace

 

frekvence

body

procento

Moraxella (Branhamella) catarrhalis

 

   103

2

  95,4%

Moraxella lacunata

 

      3

   1

    2,8%

neočekávaný patogen*

 

      2

  -1

    1,9%

Celkem

 

  108

 

  100%

* Enterococcus faecalis(1), Micrococcus luteus(1)

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.

 

            Moraxella (Branhamella) catarrhalis správně identifikovalo 103 laboratoří, 3 laboratoře označily nesprávně druh (Moraxella lacunata) a 2 laboratoře vzorek neurčily. M. (B. ) catarrhalis je oxidáza, kataláza pozitivní g-diplokok. Je kultivačně nenáročná - vyrůstá na krevním i živném agaru ve formě charakteristických kolonií. (Kolonie jsou 1-3mm velké, matné, dají se posunovat po agaru bakteriologickou kličkou). M. (B. ) catarrhalis je asacharolytická, má pozitivní test redukce nitrátů a produkuje Dnázu. M. lacunata Dnázu neprodukuje.

 

 

VZOREK 3: Stolice od pacientky s horečkou a vodnatým průjmem.

 

Odpověď: Salmonella Infantis

Vzorek dále obsahoval: Escherichia coli, Enterococcus faecalis

 

identifikace

 

frekvence

body

procento

Salmonella Infantis

 

   105

   2

   97,2%

Salmonella skupina C

 

       2

   1

     1,9%

Salmonella Virchow

 

       1

   0

     0,9%

Celkem

 

   108

 

  100%       

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.

 

Salmonella Infantis je stále třetím nejčastěji izolovaným a identifikovaným sérovarem v populaci ČR. Proto není jeho určení pro terénní laboratoře problémem. Jednalo se o kmen vykazující typické biochemické i sérologické vlastnosti, který spolehlivě identifikovalo 97% zúčastněných laboratoří. Ve třech zbylých případech bylo správné rodové zařazení, přibližně i somatická O antigenní skupina C. V případě S. Virchow se jedná o blízké, nicméně chybné, určení bičíkových antigenů 2. fáze (H1,2). Celkový výsledek svědčí o velmi dobré úrovni a možnostech identifikace S. Infantis v terénu. Neodpovídá tomu však zkušenost z naší rutinní práce, kdy NRL je žádána ročně zhruba o desítky těchto sérotypizací : v r. 2000 to bylo 74 zaslaných izolátů z 270 nahlášených do EPIDATU (35%),  letos doposud byla Salmonella Infantis  dourčena 28x.

 

 

Vzorek 4: Izolát z hemokultury od pacienta s urosepsí.

 

Odpověď: Escherichia coli

 

 

identifikace

 

frekvence

body

procento

Escherichia coli

 

107

   2

   99,1%

Citrobacter amalonaticus

 

    1

   0

     0,9%

Celkem

 

108

 

  100%

Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.

 

Požadavek byl označit signifikantního patogena a vyšetřit jeho citlivost k ampicilinu, cefotaximu, ceftazidimu, ciprofloxacinu a gentamicinu. Kmen č. 4  E. coli, který byl izolován z krve pacienta v jedné laboratoři v jižních Čechách, produkoval  širokospektrou b-laktamázu (ESBL)  a byl rezistentní  k ciprofloxacinu (MIC >4 mg/l) a ke gentamicinu (MIC >32 mg/l), odštěpoval však kolonie které byly ke gentamicinu citlivé (MIC <=0.25 mg/l), a proto se výsledky vyšetření citlivosti k tomuto antibiotiku nehodnotí.  Ze 108 laboratoří, které se zúčastnily této série EHK, 107 správně identifikovalo E. coli, jedna laboratoř  určila kmen jako Citrobacter amalonata. Všechny laboratoře rozpoznaly správně rezistenci k cefotaximu, jedna laboratoř nesprávně určila kmen jako citlivý k ampicilinu a 13 (12%) laboratoří nerozpoznalo rezistenci k ceftazidimu způsobenou produkcí ESBL. Kmen byl sice rezistentní k ceftazidimu pouze v nízkém stupni (MIC 4 mg/l),  avšak o produkci ESBL svědčila vysoká MIC cefotaximu a zejména vytvoření deformované, synergické zóny inhibice při doporučeném uspořádání disků s amoxicilinem/klavulanovou kyselinou a cefalosporiny 3. generace [1]. Celkové výsledky vyšetření citlivosti jsou v tabulce 1, která obsahuje také limitní hodnoty průměrů inhibičních zón (IZ) a minimálních inhibičních koncentrací (MIC) pro citlivé kmeny gramnegativních střevních tyček, výsledky naměřené v NRL pro antibiotika a výsledky laboratoří v kategorii citlivosti a rezistence u kmene č. 4. 

 

Tabulka 1. Výsledky vyšetření citlivosti  kmene č. 4 E. coli.

 

Průměry IZ (mm)

MIC (mg/l)

Správné výsledky

Antibiotikum

limit pro citlivé G-T [1]

rozmezí naměřené

v NRL*

limit pro citlivé G-T  [1]

hodnoty naměřené 

v NRL**

kategorie

[1]

počet laboratoří

%

 

ampicilin

>=17

6-6

<=4

>64

R

107/108

99.1

cefotaxim

>=23 (<=27***)

10-13

<=4 (>=2***)

>32

R

108/108

100.0

ceftazidim

>=18 (<=22***)

21-22

<=4 (>=2***)

4

R

95/108

88.0

ciprofloxacin

>=21

6-6

<=1

>4

R

108/108

100.0

 

* 5 měření diskovou difuzní metodou [1]; obsah disků: ampicilin 30ug, cefotaxim 30 ug, ceftazidim 30 ug, ciprofloxacin 5 ug.

** 2 měření diluční mikrometodou [1].

*** hraniční koncentrace pro pravděpodobné producenty ESBL [2].

C-citlivý, R-rezistentní.

 

Kmen č.5   Staphylococcus aureus.

Kmen č. 5 je S. aureus, kmen EARSS (UA 1450) pro kontrolu kvality. Jedná se o heterorezistentní MRSA s poměrně nízkou koncentrací buněk rezistentních k oxacilinu,  citlivý ke gentamicinu a vankomycinu. Rezistenci k oxacilinu nerozpoznalo 23 (22.3%) laboratoří, všechny laboratoře správně označily kmen jako citlivý ke gentamicinu a vankomycinu. Celkové výsledky vyšetření citlivosti jsou v tabulce 2, která obsahuje také limitní hodnoty průměrů inhibičních zón (IZ) a minimálních inhibičních koncentrací (MIC) pro citlivé kmeny S. aureus, výsledky naměřené v NRL pro antibiotika a výsledky laboratoří v kategorii citlivosti a rezistence u kmene č. 5.

 

Tabulka 2. Výsledky vyšetření citlivosti  kmene č. 5 S. aureus.

 

Průměry IZ (mm)

MIC (mg/l)

Správné výsledky

Antibiotikum

limit pro citlivé S. aureus [1]

rozmezí naměřené

v NRL*

limit pro citlivé S. aureus [1]

hodnoty naměřené 

v NRL**

kategorie

[1]

počet laboratoří

%

 

oxacilin

>=13

6-10

<=2

4

R

23/108

78.7

gentamicin

>=15

24-26

<=4

0.5

S

108/108

100.0

vankomycin

>=15

17-19

<=4

1

S

108/108

100.0

* 5 měření diskovou difuzní metodou [1]; obsah disků: oxacilin 1 ug, gentamicin 10 ug, vankomycin 30 ug.

** 2 měření mikrometodou a skríningovými  metodami na MH agaru s oxacilinem a vankomycinem [1].

C-citlivý, R-rezistentní.

 

 

Závěr

I když lze pokládat vyšetření citlivosti z této série EHK za poměrně  obtížné (u kmene č. 4 pro nízký stupeň inaktivace ceftazidimu specifickou ESBL, u kmene č. 5 pro nízkou koncentraci rezistentních buněk k oxacilinu), je třeba si uvědomit, že podobné kmeny se vyskytují v klinických vzorcích také v ČR a v části laboratoří unikají pozornosti. V EHK-269 nerozpoznalo produkci ESBL 12% laboratoří, téměř stejný počet laboratoří (11.8%) nerozpoznal produkci ESBL u Klebsiella pneumoniae WHO 12 v EHK-194 [3], lze tedy konstatovat, že v průběhu téměř dvou let nedošlo k žádnému  zlepšení. K nápravě kvality vyšetření v laboratořích, které měly chybné výsledky, lze doporučit následující postup [1, 2, 4, 5]:

1)      Průkaz ESBL: 

a)      Dodržovat pečlivě zvolenou metodu vyšetření a provádět pravidelně a často vnitřní kontrolu kvality, protože množství specifické ESBL závisí na vlastnosti kmene a podmínkách vyšetření.

b)      Pečlivě měřit průměry inhibičních zón (IZ) kolem disků nebo hodnoty MIC  a odchylky od normální distribuce vždy ověřit (viz dále).

c)      Za potenciální producenty ESBL považovat kmeny s MIC 2-4 mg/l cefotaximu či ceftazidimu nebo  průměrem IZ kolem disku s ceftazidimem (cefpodoximem)  <=22 mm  nebo kolem disku s cefotaximem (aztreonamem)  <=27  mm (při čemž obvykle IZ kolem disku s je >=18 mm); tyto kmeny je nutno ověřit (viz dále).

d)      Ověření produkce ESBL lze provést

i)        průkazem synergie (například dvojím diskovým testem pro průkaz synergie) [1]

ii)       vyšetřením průměru IZ vytvořené kolem disku s cefpodoximem (10 ug) a disku s kombinací cefpodoximu (10 ug) s 1 ug kyseliny klavulanové na jedné plotně s MH agarem; rozdíl v průměru zón inhibice o >=5 mm u kombinovaného disku svědčí o produkci ESBL [4].

2)      Průkaz MRSA:

a)      Průkaz homorezistentního MRSA nečiní potíže. Heterorezistence k oxacilinu znamená přítomnost rezistentní subpopulace s mecA genem v citlivé populaci daného kmene MRSA. Nízká koncentrace rezistentních buněk činí průkaz MRSA obtížný. Při přeočkovávání se může koncentrace rezistentních buněk snížit pod hranici detekce, zejména je-li kultivace prováděna v nevhodné teplotě po krátkou dobu. 

b)      Při vyšetření citlivosti je nezbytné pečlivě dodržovat postup; délka inkubace musí být 24 hodiny, optimální kultivační teplota je 30 oC (při vyšší teplotě se snižuje počet rezistentních buněk), inokulum musí být přiměřeně koncentrované, používá se výlučně disk o obsahu 1 ug oxacilinu.

c)      Převažující citlivá subpopulace u typicky heterorezistentního kmene vždy vytváří IZ kolem disku s oxacilinem, uvnitř které se musí pátrat po jakémkoli náznaku růstu. Rezistentní subpopulace může uvnitř IZ vytvářet velmi malé a ojedinělé kolonie, nebo lehký, přehlédnutelný povlak, projevující se pouze  zastřením.  V případě pochybností lze zaslat kmen do NRL pro antibiotika.

d)      Vyšetření se vždy doplňuje screeningovým vyšetřením na půdě obsahující NaCl a zvolenou koncentraci oxacilinu. K tomu účelu lze použít také komerční půdu z ověřeného zdroje.

 

Koordinátorka EHK-Bakteriologická diagnostika se omlouvá za záměnu legendy ve výsledkové listině EHK -269. Děkujeme za pochopení.

 

 

Literatura

 

[1] Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody. Trios 1998. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement. NCCLS document M100-S9. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Pa;1999.

[2] EHK – 194. Bakteriologická diagnostika – vyhodnocení. Zprávy CEM 2000;9(1):33-36.

[3] Carter MW, Oakton KJ, Warner M, Livermore DM. Detection of extended-spectrum b-lactamases in klebsiellae with the Oxoid combination disk method. J Clin Microbiol 2000;38:4228-4232.

[4] Jorgensen JH, Ferraro MJ. Antimicrobial susceptibility testing: special needs for fastidious organisms and difficult-to-detect resistance mechanisms. Clin Infect Dis 2000;30:799-808.

 

 

 

 

MUDr. Helena Žemličková
MUDr. Daniela Dědičová, CSc.
RNDr. Pavla Urbášková, CSc.

 

MUDr. Helena ŽemliRNDr. Pavla Urbášková, CSc.