Zprávy CEM (SZÚ,
Praha) 2001; 10(12):480-483.
Helena Žemličková, Daniela Dědičová, Pavla Urbášková
celkové hodnocení identifikací
Celkem byly rozeslány vzorky 109 laboratořím. 108 laboratoří odeslalo
výsledek do závěrečného termínu. Za 4 vzorky mohly laboratoře získat maximálně
8 bodů. Bodování bylo provedeno ve stupnici 2, 1, 0 a -1 bod.
Graf 1: Celkový výsledek laboratoří v
identifikacích ehk-269
Maximálního počtu bodů
dosáhlo 101, tj. 93,5% laboratoří. Limit pro úspěšné absolvování byl 5,818
bodů, (aritmetický průměr minus dvě směrodatné odchylky,
tj. 7,778 – (2 x 0,980) = 5,818). Tohoto limitu dosáhlo
106 laboratoří, 2 laboratoře tento limit nesplnily.
Výsledky u jednotlivých vzorků
Vzorek 1: Výtěr z cervixu
při podezření na cervicitidu. |
Odpověď: Neisseria gonorrhoeae Vzorek
dále obsahoval: Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum |
identifikace |
frekvence |
body |
procento |
Neisseria gonorrhoeae |
103 |
2 |
95,4% |
Enterococcus
faecalis |
3 |
0 |
2,8% |
Enterococcus
faecalis, Lactobacillus sp. |
2 |
0 |
1,9% |
Celkem |
108 |
|
100% |
Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.
Identifikace gonokoka nečinila laboratořím žádné obtíže. Z celkového počtu 108 zúčastněných laboratoří neizolovaly Neisseria gonorrhoeae pouze 3 laboratoře. N. gonorrhoeae je typickým původcem cervicitidy a uretritidy u mužů. Diagnostické problémy může činit faryngeální forma kapavky, která je při běžném zpracování vzorku výtěru z krku neprokazatelná. Narůstající rezistence k antibiotikům představuje problém v terapii kapavky. Vysoká prevalence rezistence k penicilinu a tetracyklinu byla již dříve popsána v jižní Asii a v Africe. V posledních narůstá rezistence k chinolonovým antibiotikům. V Japonsku v letech 1997-98 byla téměř čtvrtina (24,4%) gonokoků rezistentní k ciprofloxacinu[1], v Řecku mělo v roce 1999 sníženou citlivost k chinolonům 11,8% izolátů[2]. Výskyt epidemií způsobených kmeny se sníženou citlivostí k chinolonů byl popsán v Řecku, Velké Británii, USA, Kanadě a Austrálii. Tento jev je vysvětlován změnou epidemiologie gonokoků (vyšší přenos, delší infekčnost) a extenzivním užíváním chinolonových antibiotik[2].
Literatura
[1] Tanaka M, Nakayama H,
et al. Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae and high
prevalence of ciprofloxacin-resistant isolates in Japan, 1993 to 1998. J Clin
Microb 2000;38(2):521-525.
[2] Mavroidi A,
Tzouvelekis LS, et al. Characterization of Neisseria gonorrhoeae strains
with decreased susceptibility to fluoroquinolones isolated in Greece from 1996
to 1999. J Clin Microb 2000;38(9):3489-3491.
Vzorek 2: Výtěr z oka od
pacienta s konjuktivitidou. |
Odpověď: Moraxella (Branhamella) catarrhalis Vzorek
dále obsahoval: Staphylococcus epidermidis |
identifikace |
frekvence |
body |
procento |
Moraxella (Branhamella)
catarrhalis |
103 |
2 |
95,4% |
Moraxella lacunata |
3 |
1 |
2,8% |
neočekávaný patogen* |
2 |
-1 |
1,9% |
Celkem |
108 |
|
100% |
* Enterococcus
faecalis(1), Micrococcus luteus(1)
Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.
Moraxella (Branhamella) catarrhalis správně identifikovalo 103 laboratoří, 3 laboratoře označily nesprávně druh (Moraxella lacunata) a 2 laboratoře vzorek neurčily. M. (B. ) catarrhalis je oxidáza, kataláza pozitivní g-diplokok. Je kultivačně nenáročná - vyrůstá na krevním i živném agaru ve formě charakteristických kolonií. (Kolonie jsou 1-3mm velké, matné, dají se posunovat po agaru bakteriologickou kličkou). M. (B. ) catarrhalis je asacharolytická, má pozitivní test redukce nitrátů a produkuje Dnázu. M. lacunata Dnázu neprodukuje.
VZOREK 3: Stolice od pacientky s horečkou a vodnatým
průjmem. |
Odpověď: Salmonella Infantis Vzorek
dále obsahoval: Escherichia coli, Enterococcus faecalis |
identifikace |
frekvence |
body |
procento |
Salmonella
Infantis |
105 |
2 |
97,2% |
Salmonella
skupina
C |
2 |
1 |
1,9% |
Salmonella Virchow
|
1 |
0 |
0,9% |
Celkem |
108 |
|
100% |
Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.
Salmonella Infantis je stále třetím
nejčastěji izolovaným a identifikovaným sérovarem v populaci ČR. Proto není
jeho určení pro terénní laboratoře problémem. Jednalo se o kmen vykazující
typické biochemické i sérologické vlastnosti, který spolehlivě identifikovalo
97% zúčastněných laboratoří. Ve třech zbylých případech bylo správné rodové
zařazení, přibližně i somatická O antigenní skupina C. V případě S. Virchow se jedná o blízké, nicméně
chybné, určení bičíkových antigenů 2. fáze (H1,2). Celkový výsledek svědčí o
velmi dobré úrovni a možnostech identifikace S. Infantis v terénu. Neodpovídá tomu však zkušenost
z naší rutinní práce, kdy NRL je žádána ročně zhruba o desítky těchto
sérotypizací : v r. 2000 to bylo 74 zaslaných izolátů z 270 nahlášených do
EPIDATU (35%), letos doposud byla
Salmonella Infantis dourčena 28x.
Vzorek 4: Izolát z hemokultury od pacienta s urosepsí. |
Odpověď: Escherichia coli |
identifikace |
frekvence |
body |
procento |
Escherichia coli |
107 |
2 |
99,1% |
Citrobacter amalonaticus
|
1 |
0 |
0,9% |
Celkem |
108 |
|
100% |
Z 20 laboratoří s nejvyšším dosaženým počtem bodů za minulý rok uvedlo správný výsledek 20 laboratoří. Vzorek je možno hodnotit.
Požadavek byl označit
signifikantního patogena a vyšetřit jeho citlivost k ampicilinu,
cefotaximu, ceftazidimu, ciprofloxacinu a gentamicinu. Kmen č. 4 E. coli, který byl izolován
z krve pacienta v jedné laboratoři v jižních Čechách,
produkoval širokospektrou b-laktamázu (ESBL) a byl rezistentní k ciprofloxacinu (MIC >4 mg/l) a
ke gentamicinu (MIC >32 mg/l), odštěpoval však kolonie které byly ke
gentamicinu citlivé (MIC <=0.25 mg/l), a proto se výsledky vyšetření
citlivosti k tomuto antibiotiku nehodnotí. Ze 108 laboratoří, které se zúčastnily této série EHK, 107
správně identifikovalo E. coli, jedna laboratoř určila kmen jako Citrobacter amalonata.
Všechny laboratoře rozpoznaly správně rezistenci k cefotaximu, jedna
laboratoř nesprávně určila kmen jako citlivý k ampicilinu a 13 (12%)
laboratoří nerozpoznalo rezistenci k ceftazidimu způsobenou produkcí ESBL.
Kmen byl sice rezistentní k ceftazidimu pouze v nízkém stupni (MIC 4
mg/l), avšak o produkci ESBL svědčila
vysoká MIC cefotaximu a zejména vytvoření deformované, synergické zóny inhibice
při doporučeném uspořádání disků s amoxicilinem/klavulanovou kyselinou a
cefalosporiny 3. generace [1]. Celkové výsledky vyšetření citlivosti jsou
v tabulce 1, která obsahuje také limitní hodnoty průměrů inhibičních zón
(IZ) a minimálních inhibičních koncentrací (MIC) pro citlivé kmeny
gramnegativních střevních tyček, výsledky naměřené v NRL pro antibiotika a
výsledky laboratoří v kategorii citlivosti a rezistence u kmene č. 4.
Tabulka 1. Výsledky vyšetření
citlivosti kmene č. 4 E. coli.
|
Průměry IZ (mm) |
MIC (mg/l) |
Správné výsledky |
||||
Antibiotikum |
limit pro citlivé
G-T [1] |
rozmezí naměřené v NRL* |
limit pro
citlivé G-T [1] |
hodnoty
naměřené v NRL** |
kategorie [1] |
počet laboratoří |
% |
ampicilin |
>=17 |
6-6 |
<=4 |
>64 |
R |
107/108 |
99.1 |
cefotaxim |
>=23 (<=27***) |
10-13 |
<=4 (>=2***) |
>32 |
R |
108/108 |
100.0 |
ceftazidim |
>=18 (<=22***) |
21-22 |
<=4 (>=2***) |
4 |
R |
95/108 |
88.0 |
ciprofloxacin |
>=21 |
6-6 |
<=1 |
>4 |
R |
108/108 |
100.0 |
* 5 měření diskovou difuzní metodou [1]; obsah disků: ampicilin 30ug,
cefotaxim 30 ug, ceftazidim 30 ug, ciprofloxacin 5 ug.
** 2 měření diluční mikrometodou [1].
*** hraniční koncentrace pro pravděpodobné producenty ESBL [2].
C-citlivý, R-rezistentní.
Kmen
č.5 Staphylococcus aureus.
Kmen č. 5 je S. aureus,
kmen EARSS (UA 1450) pro kontrolu kvality. Jedná se o heterorezistentní MRSA
s poměrně nízkou koncentrací buněk rezistentních k oxacilinu, citlivý ke gentamicinu a vankomycinu.
Rezistenci k oxacilinu nerozpoznalo 23 (22.3%) laboratoří, všechny
laboratoře správně označily kmen jako citlivý ke gentamicinu a vankomycinu.
Celkové výsledky vyšetření citlivosti jsou v tabulce 2, která obsahuje
také limitní hodnoty průměrů inhibičních zón (IZ) a minimálních inhibičních
koncentrací (MIC) pro citlivé kmeny S. aureus, výsledky naměřené
v NRL pro antibiotika a výsledky laboratoří v kategorii citlivosti a
rezistence u kmene č. 5.
Tabulka 2. Výsledky vyšetření
citlivosti kmene č. 5 S. aureus.
|
Průměry IZ (mm) |
MIC (mg/l) |
Správné výsledky |
||||
Antibiotikum |
limit pro citlivé S.
aureus [1] |
rozmezí naměřené v NRL* |
limit pro
citlivé S. aureus [1] |
hodnoty
naměřené v NRL** |
kategorie [1] |
počet laboratoří |
% |
oxacilin |
>=13 |
6-10 |
<=2 |
4 |
R |
23/108 |
78.7 |
gentamicin |
>=15 |
24-26 |
<=4 |
0.5 |
S |
108/108 |
100.0 |
vankomycin |
>=15 |
17-19 |
<=4 |
1 |
S |
108/108 |
100.0 |
* 5 měření diskovou difuzní metodou [1]; obsah disků: oxacilin 1 ug,
gentamicin 10 ug, vankomycin 30 ug.
** 2 měření mikrometodou a skríningovými metodami na MH agaru s oxacilinem a vankomycinem [1].
C-citlivý, R-rezistentní.
Závěr
I když lze pokládat vyšetření
citlivosti z této série EHK za poměrně
obtížné (u kmene č. 4 pro nízký stupeň inaktivace ceftazidimu
specifickou ESBL, u kmene č. 5 pro nízkou koncentraci rezistentních buněk k
oxacilinu), je třeba si uvědomit, že podobné kmeny se vyskytují
v klinických vzorcích také v ČR a v části laboratoří unikají
pozornosti. V EHK-269 nerozpoznalo produkci ESBL 12% laboratoří, téměř
stejný počet laboratoří (11.8%) nerozpoznal produkci ESBL u Klebsiella
pneumoniae WHO 12 v EHK-194 [3], lze tedy konstatovat, že
v průběhu téměř dvou let nedošlo k žádnému zlepšení. K nápravě kvality vyšetření v laboratořích,
které měly chybné výsledky, lze doporučit následující postup [1, 2, 4, 5]:
1)
Průkaz ESBL:
a)
Dodržovat
pečlivě zvolenou metodu vyšetření a provádět pravidelně a často vnitřní kontrolu
kvality, protože množství specifické ESBL závisí na vlastnosti kmene a
podmínkách vyšetření.
b)
Pečlivě
měřit průměry inhibičních zón (IZ) kolem disků nebo hodnoty MIC a odchylky od normální distribuce vždy
ověřit (viz dále).
c)
Za
potenciální producenty ESBL považovat kmeny s MIC 2-4 mg/l cefotaximu či
ceftazidimu nebo průměrem IZ kolem
disku s ceftazidimem (cefpodoximem)
<=22 mm nebo kolem disku
s cefotaximem (aztreonamem)
<=27 mm (při čemž obvykle IZ
kolem disku s je >=18 mm); tyto kmeny je nutno ověřit (viz dále).
d)
Ověření
produkce ESBL lze provést
i)
průkazem
synergie (například dvojím diskovým testem pro průkaz synergie) [1]
ii)
vyšetřením
průměru IZ vytvořené kolem disku s cefpodoximem (10 ug) a disku
s kombinací cefpodoximu (10 ug) s 1 ug kyseliny klavulanové na jedné
plotně s MH agarem; rozdíl v průměru zón inhibice o >=5 mm u
kombinovaného disku svědčí o produkci ESBL [4].
2)
Průkaz MRSA:
a)
Průkaz
homorezistentního MRSA nečiní potíže. Heterorezistence k oxacilinu znamená
přítomnost rezistentní subpopulace s mecA genem v citlivé
populaci daného kmene MRSA. Nízká koncentrace rezistentních buněk činí průkaz
MRSA obtížný. Při přeočkovávání se může koncentrace rezistentních buněk snížit
pod hranici detekce, zejména je-li kultivace prováděna v nevhodné teplotě
po krátkou dobu.
b)
Při
vyšetření citlivosti je nezbytné pečlivě dodržovat postup; délka inkubace musí
být 24 hodiny, optimální kultivační teplota je 30 oC (při vyšší
teplotě se snižuje počet rezistentních buněk), inokulum musí být přiměřeně
koncentrované, používá se výlučně disk o obsahu 1 ug oxacilinu.
c)
Převažující
citlivá subpopulace u typicky heterorezistentního kmene vždy vytváří IZ kolem
disku s oxacilinem, uvnitř které se musí pátrat po jakémkoli náznaku růstu.
Rezistentní subpopulace může uvnitř IZ vytvářet velmi malé a ojedinělé kolonie,
nebo lehký, přehlédnutelný povlak, projevující se pouze zastřením.
V případě pochybností lze zaslat kmen do NRL pro antibiotika.
d)
Vyšetření
se vždy doplňuje screeningovým vyšetřením na půdě obsahující NaCl a zvolenou
koncentraci oxacilinu. K tomu účelu lze použít také komerční půdu
z ověřeného zdroje.
Koordinátorka
EHK-Bakteriologická diagnostika se omlouvá za záměnu legendy ve výsledkové
listině EHK -269. Děkujeme za pochopení.
Literatura
[1] Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané
metody. Trios 1998. National Committee for Clinical Laboratory Standards.
Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth
informational supplement. NCCLS document M100-S9. National Committee for
Clinical Laboratory Standards, Pa;1999.
[2] EHK – 194. Bakteriologická diagnostika – vyhodnocení.
Zprávy CEM 2000;9(1):33-36.
[3] Carter MW, Oakton KJ, Warner M,
Livermore DM. Detection of extended-spectrum b-lactamases in klebsiellae with the Oxoid
combination disk method. J Clin Microbiol 2000;38:4228-4232.
[4] Jorgensen JH, Ferraro MJ.
Antimicrobial susceptibility testing: special needs for fastidious organisms
and difficult-to-detect resistance mechanisms. Clin Infect Dis 2000;30:799-808.
MUDr. Helena ŽemliRNDr. Pavla Urbášková, CSc.