Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2002; 11(2): 82-86.

 

Kvantitativní PCR  (Q-PCR)

 

Markéta  Priglová, Jaroslav König

 

Souhrn

            Molekulárně biologické metody jsou již běžně využívány v klinické laboratorní diagnostice včetně kvantitativního stanovení DNA, případně RNA. V poslední době byly vyvinuty  rychlé, vysoce citlivé a specifické metody, které umožňují průběžné sledování tvorby PCR produktů již během jednotlivých amplifikačních cyklů a vyznačují se velmi dobrou reprodukovatelností. Velkou výhodou těchto moderních metod je široké detekční rozmezí v rozsahu několika řádů. Doprovází je i vývoj nových typů termálních cyclerů a  metodických  přístupů k detekci amplifikovaných produktů (amplikon). V našem příspěvku popisujeme principy jak starších tak moderních postupů pro kvantitativní stanovení DNA.  Lze je použít i pro kvantifikaci RNA, pokud ji můžeme reprodukovatelně převést revezní transkripcí do cDNA.

 

            Výsledky získané amplifikací dianosticky zajímavých úseků lidského, bateriálního nebo virového genomu  metodou PCR poskytují vysokou výpovědní hodnotu jak pro ošetřujícího lékaře, tak pro výzkum. Umožňují přiblížit se  kauzální diagnostice a následně monitorovat průběh onemocnění, případně léčbu. Získané výsledky mohou mít tak i vysokou prognostickou hodnotu. Jediným omezením a tedy i nevýhodou dosud používaných postupů bylo jejich metodicky náročné a pouze jen orientační, kvantitativní hodnocení. Vyplývá to z charakteru  závislosti množství vytvořeného produktu na počtu cyklů PCR, připomínající průběhem růstovou křivku, včetně stacionární fáze (obr.1) (obrázky jsou pouze v tištěné formě časopisu).  Pro zajištění maximální citlivosti  často volíme u klasické PCR větší počet cyklů (30 až 60), kdy je však produkt amplifikace již ve stacionární fázi a nelze tak z jeho množství odvodit původní koncentraci vzorku.

 

V současné době lze metody využívající PCR pro kvantifikaci DNA nebo RNA rozdělit do dvou skupin:

              A) end-point Q-PCR, kdy je produkt vyhodnocen až po ukončení PCR

              B) real-time Q-PCR,  kde  měření nárůstu produktu  probíhá  již během amplifikace.

 

A)  End-point Q-PCR

Mezi end-point Q-PCR  zahrnujeme dva postupy:  1) komparativní  a  2) kompetitivní.

            1) Při komparativním, též označovaném jako nekompetitivní Q-PCR, porovnáváme koncentrace amplifikovaného vzorku s kalibrační křivkou standardu, který je paralelně nebo společně amplifikován se vzorkem a nemusí  s ním mít shodné primery .

            2) Kompetitivní Q-PCR (QC-PCR) je založena na společné amplifikaci cílové sekvence pozitivního vzorku a vnitřního standardu (IS) o známé koncentraci.  IS je pro konečné kvantitativní hodnocení klíčovou složkou. IS je amplifikován společně s vyšetřovaným vzorkem a s použitím shodných primerů jak pro vzorek tak i pro IS. Tím je zajištěna i stejná amplifikační účinnost PCR.  Připravený, uměle konstruovaný,  IS musí vyhovovat následujícím podmínkám: i) musí být amplifikován stejnými primery, ii) měl by mít podobné procentuální zastoupení guanidinu a cytosinu jaké má cílová sekvence vzorku, iii) musí být dobře odlišitelný od amplifikovaného vzorku. Pro finální analýzu se IS liší podle vybraného způsobu detekce například velikostí sekvence, přítomností nebo absencí restrikčního místa případně odlišnou sekvencí pro specifickou hybridizaci a atd. Podle složení nukleotidové  sekvence se IS dělí na homologní a heterologní. Sekvence nukleotidů je u homologního IS shodná s vyšetřovanou DNA, ale obsahuje  navíc specifickou inzerci nebo deleci pro odlišení od vzorku při detekci, jak bylo uvedeno výše. U heterologního IS je kromě úseků pro nasednutí primerů, jeho sekvence odlišná. Při použití homologního IS hrozí riziko vzniku heteroduplexů, které se mohou vytvořit mezi cílovou sekvencí a IS v pozdějších stadiích PCR, kdy je již koncentrace produktů vysoká. Kvantitativní vyhodnocení získáme  z kalibrační křivky porovnáním signálu vzorku se signálem IS, jehož koncentraci známe (obr.2).

 

Výhodou obou postupů je kromě kvantifikace též odhalení případné inhibice PCR a tím i falešné negativity. Pokud u vyšetřovaného vzorku, ale i u IS nezaznamenáme  po amplifikaci pozitivní signál jde zřejmě o inhibici PCR a nález nelze interpretovat jako negativní. Nevýhodou popsaných postupů je časová a materiálová náročnost. Koncentraci vzorku i standardu je nutné přizpůsobit ředěním a vzhledem k již uvedenému charakteru dynamiky PCR je možné těmito postupy stanovit jen úzké rozmezí koncentrací. U komparativního postupu je též nutno počítat s možností  různého průběhu amplifikace vzhledem k rozdílnému složení standardu a vyšetřovaného vzorku.

 

B)  Real-time Q-PCR

            Nedostatky uvedené v předcházejícím oddíle jsou do značné míry odstraněny tzv. PCR v reálném čase, real-time PCR, označované též jako kinetická PCR. Poznatky, které k ní položily základ, byly získány v letech 1991-1992, kdy Higuchi a spol. vytvořili systém, s jehož pomocí bylo možné zaznamenat produkty PCR bezprostředně po jejich vzniku, po každém jednotlivém cyklu PCR. Využili přitom dobře známé vlastnosti interkalačního barviva ethidiumbromidu (Et-Br), který po ozáření UV fluoreskuje (fluorofor). Lze tak využít fixace Et-Br u nově vytvořené dvouřetězcové DNA (dsDNA) a měřit zvyšující se intenzitu fluorescenčního záření již během PCR. U upraveného cycleru byly během amplifikace ozařovány vzorky UV zářením (530nm) a výslednou fluorescenci snímala CCD-kamera napojená na počítač [1]. V současné době jsou pro kvantifikaci DNA využívána i jiná interkalační barviva, např. SYBR Green I (obr.3). Pro specifickou detekci jsou používány komplementární specifické sondy (TaqMan, Hi probes-Dual Probes, Molecular Beacons), universální primery Amplifluor a podobně. Nevýhodou interkalačních barviv je, že nerozlišují případnou kontaminaci nespecifickou dsDNA a mohou  zvyšovat pozadí interkalací barvičky mezi dimery primerů.  V současné době se Et-Br  pro malou citlivost a specifitu již nepoužívá.

 

            Selektivita detekce je, jak již bylo řečeno, zajištěna specifickými sondami. V současných systémech se často využívá interakce dvojice fluoroforů, které jsou vázány na 5´ a 3´ konci oligonukleotidové sondy, většinou o 20-30 nukleotidech. Jeden z nich, na 5´ konci sondy, má funkci zářiče (reporter, „R“), druhý, na 3´ konci sondy, má funkci zhášeče (quencher „Q“). U sondy v intaktním stavu zhášeč tlumí záření emitované zářičem a to procesem tzv. Foerstrova resonančního přenosu energie (FRET). Po vazbě sondy ke komplementárnímu úseku jednořetězcové nukleové kyseliny dojde k odštěpení nebo oddálení zhášeče a zářič,  který se tak vymanil z tlumivého vlivu zhášeče, emituje fluorescenci. Fluorescenční záření  je zaznamenáno přístrojovým analyzátorem a s každou vytvořenou molekulou amplikonu narůstá jeho intenzita.  V závislosti na počtu cyklů, případně ještě z kalibrační křivky paralelně amplifikované vnitřního standardu, je pak možno stanovit koncentraci neznámého vzorku. Metodické přístupy vypracované  ve vývojových laboratořích pro komerční aplikace se liší jak principem detekce tak i způsobem dosažení teplotních změn jednotlivých kroků PCR cyklu. Některé zajímavé přístupy jsou uvedeny dále.

 

            TaqMan metoda ( fa PE Biosystems) využívá jedné kratší sondy fluorescenčně značené na obou koncích (na 5´konci zářič, na 3´konci zhášeč). Ve výchozím stavu je fluorescence blízkým zhášečem potlačena. V reasociační (annealing) fázi PCR dojde k hybridizaci sondy k cílovému místu vytvořeného amplikonu.  Záření je zatím ještě potlačováno zhášečem. Při následném kroku, při vytváření nového řetězce (elongaci) postupující Taq polymerása svojí 5´exonukleázovou aktivitou nejdříve rozruší komplex sondy s cílovou sekvencí  DNA. Poté dojde k exonukleázovému rozštěpení TaqMan sondy, čímž dojde k ukončení efektu zhášení (obr.4). Vzniklá  fluorescence je měřena na konci této elongační, syntetické fáze PCR.

 

            Princip použitý v systému LightCycler (fa ROCHE) je v současné době jednou z nejvýznamnějších inovací v oblasti PCR. Změny teplot v rámci amplifikačního profilu jednotlivých teplotních kroků PCR cyklu se dosahují mícháním horkého vzduchu ohřátého tepelným zdrojem a vzduchu pokojové teploty přicházejícího zvenčí. Teplotní senzory v termální komoře jsou schopny zajistit naprogramovanou teplotu s přesností ± 0,3°C. V kombinaci s amplifikačními kapilárami vyrobenými z borosilikátového skla proběhne jeden amplifikační cyklus za méně než 30 sekund. V LightCycler systému je možno použít jak SYBR Green I, tak specifické sondy. V druhém případě jsou základem dvě hybridizační sondy označené rozdílnými fluoroescenčními barvičkami: první sonda je označena na 3´konci fluoresceinem a plní funkci donorové barvičky; druhá sonda je označena na 5´konci, např. LightCycler Red 640 a  slouží jako akceptorová barvička.

 

Obě sondy jsou navrženy tak, aby v reasociační fázi přisedaly k cílové sekvenci v těsné blízkosti s maximálním oddálením 1-5 nukleotidů a mohly tak plnit funkci donora a akceptora (obr.5). Kapilára s probíhající PCR je v měřícím kanálu osvícena  UV zářením o vlnové délce 470 nm, čímž dojde k excitaci donorové barvičky, která emituje zelené fluorescenční světlo, kterým je excitován akceptor. Výsledkem je emise červeného fluorescenčního světla, které je měřeno na konci reasociační fáze PCR. Po reasociační fázi dochází v dalším kroku k vzestupu teploty, což má za následek oddělení hybridizovaných sond od cílových sekvencí  (denaturace) a při dalším cyklu se děj opakuje. Přístroj je schopen měřit fluorescenci ve třech oddělených kanálech najednou. Výběr filtru závisí na použité fluorescenční barvičce: 1. kanál měří fluorescenci při 530 nm a je používán pro SYBR Green I a fluorescein; 2. kanál (640 nm) je používán k měření signálu z LC-Red 640; 3. kanál (710 nm) je navrhnut pro LC-Red 705. Zásobník obsahuje 32 kapilár a jeho otočení a změření trvá 5 sekund. LightCycler tak představuje amplifikační zařízení s dosud nejuniverzálnějším použitím jak pro klasickou tak Q-PCR. Umožňuje širokou variabilitu použítých sond a  současnou analýzu několika cílových sekvencí v jednom běhu.

 

            Systém Molecular Beacons (molekulové signály) využívá vysoce specifické sondy, které mají tvar  vlásenky, jejichž střed (15-30 nukleotidů) je komplementární k cílové sekvenci, a okrajové úseky (6 nukleotidů) které jsou komplementární navzájem. Na jednom konci sondy je připojen zářič a na druhém konci zhášeč. Volná sonda nesvítí (uplatňuje se zde opět efekt zhášení). Po hybridizaci, připojení sondy ke komplementární jednořetězcové DNA (ssDNA) se zářič, vzhledem k dostatečnému oddálení od zhášeče, rozsvítí (obr.6). Fluorescence je opět měřena na konci reasociační fáze PCR.

            Další zlepšení bylo dosaženo univerzálními primery „Amplifluor“ (fa Intergen), které vytvářejí vlásenku s jedním prodlouženým koncem a jsou označeny na jednom konci zářičem a uprostřed, před začátkem prodloužení, zhášečem. Na počátku probíhá amplifikace za pomoci  selektivních primerů P1 a P2, přičemž P1 je plně komplementární k začátku amplifikované sekvence a P2 obsahuje 3´ konec a nástavec "Z", komplementární k prodlouženému ramenu vlásenky univerzálního primeru. V prvním cyklu PCR se vytvoří kopie k původní DNA vzorku. V druhém cyklu vznikne kopie končící na 3´ konci sekvencí Z´. Počínaje dalším cyklem se začíná syntetizovat od P1 primeru řetězec, na jehož konci dojde k rozbalení vlásenky a tím dojde ke zrušení zhášení, v důsledku oddálení zářiče od zhášeče (obr.7). Fluorescence se sice objeví se zpožděním několika cyklů a zvyšuje se pomaleji, zato však vypovídá velmi specificky o tom, jak probíhá PCR. Důležité je, že pro každý nový vzorek není vyžadována syntéza nového, fluorescenčně značeného detekčního primeru nebo sondy, jako v předcházejících případech. Z uvedeného hlediska je uvedený přístup levnější oproti předcházejícím systémům.

 

            Na závěr  můžeme říci, že při real time PCR jsou prakticky odstraněny všechny uvedené nevýhody end-point systémů. Průběh amplifikace lze kontrolovat průběžně a porovnání s příslušným standardem lze provést v optimálním bodě amplifikace. Má široký dynamický rozsah stanovení koncentrace v rozsahu několika řádů, zvyšuje přesnost, probíhá v uzavřeném systému, redukuje chyby a podmínky PCR lze poměrně rychle optimalizovat. Někteří autoři uvádějí, že i citlivost je o 3 až 4 řády vyšší než u klasické PCR. Je zřejmé, že uvedené Q-PCR metody lze použít i v jednodušším uspořádání pro pouhou identifikaci, bez nároků na kvantifikaci a jsou tak velkým přínosem pro moderní laboratorní molekulárně biologickou diagnostiku.

 

LITERATURA

 

[1]   Higuchi et al. (1993), Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions.  Biotechnology 1993; 11: 1026-1030.

  

 

Markéta  Priglová, Jaroslav König

SZÚ – CEM

 

 

Nadpisy k jednotlivým obrázkům (obrázka jsou uvedeny pouze v tištěné formě časopisu).

 

 

Obr. 1. :  Dynamika PCR amplifikace

 

Obr. 2. :  Princip vyhodnocení kompetitivní PCR

 

Obr. 3. :  Interkalace ( vmezeření) barviva SYBR Green I mezi řetězce dsDNA

 

Obr. 4. :  Princip „TaqMan“  metody

 

Obr. 5. :  Princip indukce záření u „LightCycler“ systému

 

Obr. 6. :  Rozbalení vlásenkové sondy „MolecularBeacons“

 

Obr. 7. :  Funkce univerzálních primerů  „Amplifluor“