Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2001; 11(3):134-136.

 

EHK - 259  Sérologie respiračních virů

 

 

Radomíra Limberková, Marie Otavová

 

I.  Obecně

     V jednotlivých sériích EHK jsou zúčastněným laboratořím zasílány různé kombinace vzorků lidských inaktivovaných sér pro vyšetření komplement fixačních protilátek proti následujícím antigenům: adenovirus, respirační syncytiální virus, influenza A(H1N1), influenza A(H3N2), influenza B. V roce 2001 byla do této sestavy poprvé zařazena i Mycoplasma pneumoniae, jako významný patogen akutních respiračních onemocnění (ARO) s těžším klinickým průběhem.

     U vzorků sér požadujeme stanovení titru protilátek metodou vazby komplementu (KFR), což nepovažujeme za samoúčelné, protože  tato metoda je základním postupem sérologického vyšetřování párových sér, na jejichž pozitivních výsledcích je postaveno hlášení ARO (zejména u nechřipkových respiračních virů a Mycoplasma pneumoniae, u chřipky pak společně s testem inhibice hemaglutinace - HIT).

     KFR je metoda specifická, citlivá, levná, nenáročná na technické vybavení laboratoře a potřebná diagnostika jsou lehce dostupná v různých komerčních firmách. Metoda umožňuje testování většího počtu sér s několika antigeny současně a výsledky vyšetření párových sér jsou snadno interpretovatelné.

     Na několika pracovištích účastnících se EHK se KFR nepoužívá a séra jsou zde vyšetřována jen metodou ELISA. I tento test má v diagnostice své místo, ale pro účely vyšetřování ARO je zbytečně drahý a navíc pouze kvalitativní výsledky nelze zodpovědně zinterpretovat ve vztahu ke stávajícímu onemocnění. Ani doplňkové vyšetření IgM protilátek, jejichž vzestup (pokud se nejedná o primoinfekci) nastupuje téměř současně se vzestupem IgG protilátek a jejichž hladina setrvává také poměrně dlouho, neumožní u ARO odvodit závěr se spolehlivou výpovědní hodnotou.

     Jak všichni dobře víme, negativní výsledek při vyšetření jednoho vzorku séra neznamená, že se nejedná o rekurentní infekci (sérum odebrané v akutní fázi) a zase naopak, pozitivní výsledek neznamená, že se o rekurentní infekci jedná (i měsíce přetrvávající titry protilátek). Interpretace takových výsledků je téměř nemožná a snad i proto mohou nastat případy jako ten, kdy lékařka odmítla provést chirurgický zákrok u pacientky, která měla v séru komplement fixační protilátky v titru 1:16 proti Mycoplasma pneumoniae s tím, že pacientka není zdravá. Pacientka přitom nejevila žádné příznaky respiračního infektu a nemocná byla před půl rokem.

     Počet laboratoří zapojených do EHK se postupem let zvyšuje. Rozptyl procent úspěšnosti mezi jednotlivými laboratořemi je dosti značný a přestože zatím všechny laboratoře všemi EHK „prošly“, setkáváme se při hodnocení se závažnými nedostatky u některých z nich. I o výsledky těchto laboratoří se opírá hlášení ARO, a proto vítáme všechny zájemce o konzultace a stáže (v NRL pro chřipku i v NRL pro nechřipkové respirační viry), které laboratořím nabízíme k zdokonalení a sjednocení metodiky KFR.

 

II. EHK - 259  Sérologie respiračních virů - hodnocení

     Vzorky byly rozeslány do 27 laboratoří, 26 laboratoří zaslalo své protokoly zpět.

Zásilka obsahovala 4 vzorky neředěných inaktivovaných sér o objemu 0,4 ml, třem laboratořím, které požadovaly větší objem vzorků do automatických systémů, bylo zasláno po 1 ml séra. Vzorky připravila sérologická laboratoř odborné skupiny vzdušných nákaz virového původu.

     Úkolem laboratoří bylo stanovit titry protilátek metodou vazby komplementu (KFR) u 5 následujících antigenů: influenza A(H1N1), A(H3N2), influenza B, adenovirus (AV), Mycoplasma pneumoniae (MP).

     15 laboratoří bylo schopno vyšetřit vzorky v KFR se všemi antigeny, 2 laboratoře neprovádějí vyšetření M.pneumoniae  v KFR a 6 laboratoří nevyšetřuje influenzu A subtypově.

     3 laboratoře zpracovaly  vzorky metodou ELISA, z toho pak 1 laboratoř vyšetřila vzorky pouze na M.pneumoniae.

     Hodnocení bylo provedeno následovně:

výsledek shodný s výsledkem NRL                  2 body

posun o 1 ředění (±)                                        1 bod

nesprávný výsledek                                          0 bodů

     Podle počtu vyšetřovaných antigenů mohly laboratoře získat maximálně 40 bodů, respektivě 32 bodů u laboratoří, které nevyšetřují všechny antigeny.
Správné výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 a 2.

 

  Tabulka 1: správné výsledky  (KFR)

 

Č. vzorku

Titry protilátek v KFR

A(H1N1)

A(H3N2)

B

AV

MP

1

<8

<8

<8

<8

512

2

<8

 8

 8

32

<8

3

<8

<8

<8

<8

<8

4

512

256

<8

16

<8

Maximum bodů

 8

 8

 8

 8

 8

Æ získaných bodů

5,5

6,1

5,91

6,04

6,38

 

 

Tabulka 2:  správné výsledky (ELISA)

 

 

Č. vzorku

IgG protilátky (titry v ELISA)

Kvalitativně

A

B

AV

MP (IgM)

1

800

1600

1600

+

2

800

1600

6400

-

3

<100

<100

<100

-

4

>12800

1600

3200

-

 

Pro hodnocení byly laboratoře rozděleny do 4 skupin podle metody a počtu vyšetřovaných antigenů – viz tabulka 3.

 

Tabulka 3: hodnocení laboratoří

 

I. SKUPINA            METODA VAZBY KOMPLEMENTU        5 ANTIGENů

15 laboratoří - maximum bodů 40

Počet dosažených bodů

Počet laboratoří

% úspěšnosti

35

2

87,5

34

1

85,0

33

2

82,5

32

1

80,0

31

2

77,5

29

2

72,5

28

2

70,0

27

1

67,5

23

2

57,5

II. SKUPINA           METODA VAZBY KOMPLEMENTU        4 ANTIGENY

                                                                       (2x bez MP, 6x bez subtypů chřipky A)

8 laboratoří - maximum bodů 32

Počet dosažených bodů

Počet laboratoří

% úspěšnosti

26

1

81,2

25

2

78,1

24

1

75,0

23

2

71,87

22

1

68,75

21

1

65,6

III. SKUPINA                        METODA ELISA                              4 ANTIGENY

2 laboratoře - maximum bodů 32

Počet dosažených bodů

Počet laboratoří

% úspěšnosti

32

2

100

IV. SKUPINA                        METODA ELISA                          1 ANTIGEN (MP)

1 laboratoř - maximum bodů 16

Počet dosažených bodů

Počet laboratoří

% úspěšnosti

12

1

75

 

Hodnocení laboratoří je shrnuto v tabulce č.4.

 

Tabulka  4: hodnocení laboratoří – limity

 

SKUPINA               

LIMIT

I.

39,30

II.

38,76

III.

52,50

IV.

39,38

 

 

Překvapující výsledky v EHK - 259
CF antigen MP Virion (č.š. 5824230205)

Titry vzorku č.1 (výsledek NRL 1:512): výsledky 5 laboratoří

1 : 256

1 : 256

1 : 128

1 : 128

< 1 : 8 !

CF antigen A1  IMUNA (č.š. 655699)                                

Titry vzorku č.4 (výsledek NRL  1:512): výsledky 1 laboratoře                                  

< 1 : 8 !

CF antigen A Virion (šarže neuvedena)

Titry vzorku č.4 (výsledek NRL  1 : 512): výsledky 1 laboratoře                       

1 : 16 !

CF antigen MP Imuna (č.š. 920297)

Titry vzorku č.4 (výsledek NRL  < 1 : 8): výsledky 1 laboratoře        

> 1 : 128 !

Podle  těchto výsledků je patrné, jak důležité je mít systém metody vazby komplementu dobře vyvážený.

 

Metoda vazby komplementu - KFR

     Používáme nejvyšší ředění komplementu, u něhož 2 jednotky a 1 jednotka vykazují kompletní hemolýzu a 0,5 jednotky a 0,25 jednotky mají úplnou zábranu hemolýzy (kontroly jednotek komplementu  -  -  4  4 )  viz tabulka 5.

 

Tabulka 5: Příklad vlivu ředění komplementu na výši titrů sér  u Mycoplasma pneumoniae

 

      KONTROLY   JEDNOTEK  KOMPLEMENTU

    VÝŠE  TITRů SÉR

Ředění komplementu

2 j

1 j

1/2 j

1/4 j

a

b

c

1:20

 -

 -

4

4

64

8

16

1:25

 -

 -

4

4

128

16

32

1:30

 -

 -

4

4

256

32

32

 

hemolýza

sedimentované krvinky

 

 

 

  

Závěr k EHK-259

     Všechny laboratoře překročily požadované limity a úspěšně absolvovaly EHK s omezením podle spektra vyšetřovaných antigenů a metod. Z tabulky 1 vyplývá, že v diagnostice jednotlivých agens nejsou výrazné rozdíly.

     Vzhledem k nízké výpovědní hodnotě získaných výsledků by vyšetřování sér na respirační viry metodou ELISA nemělo být jedinou sérologickou metodou používanou v laboratořích. Protilátky v těle pacienta přetrvávají poměrně dlouhou dobu (i několik měsíců u IgG a do 1 měsíce u IgM) a jejich přítomnost v séru pacienta nemusí nutně mít etiologickou souvislost s rekurentním onemocněním. Samotný výsledek přítomnosti protilátek v séru pacienta může být zavádějící a měl by být v tomto smyslu interpretován.

 

 

 

III. EHK  Sérologie respiračních virů - celkové hodnocení posledních šesti let (1996 - 2001)

 

 

          Hodnocení Externího hodnocení kvality – sérologie respiračních virů za léta 1996 – 2001 je shrnuto v tabulkách 6 a 7.

 

 

 

 

 

 

Tabulka 6: Celkové hodnocení EHK sérologie resp.virů  1996-2001  

Číslo EHK

Počet hodnocených

Max. počet

% úspěšnosti

Rozmezí

 

laboratoří

bodů

 

% úspěšnosti

65/96

19

26

79,91%

96,15 – 57,69%

91/97

18

40

80,62%

92,5 – 65%

133/98

22

40

75,53%

95 – 50%

173/99

19

40

91,25%

97,5 – 85%

216/00

19

32

70,56%

96,88 – 34,38%

259/01

26

40

74,70%

87,5 – 57,5%

 

                                                                        

 

Tabulka 7: Deset nejúspěšnějších laboratoří v EHK  -  Sérologie respiračních virů
v letech 1996 - 2001

 

 

KÓDY č. :            371               38               209               344               20

        44              316                39               365               13

 

 

 

MUDr.Radomíra Limberková

RNDr.Marie Otavová