Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2001; 11(3):134-136.
EHK - 259 Sérologie
respiračních virů
I. Obecně
V jednotlivých sériích EHK jsou zúčastněným laboratořím zasílány různé kombinace vzorků lidských inaktivovaných sér pro vyšetření komplement fixačních protilátek proti následujícím antigenům: adenovirus, respirační syncytiální virus, influenza A(H1N1), influenza A(H3N2), influenza B. V roce 2001 byla do této sestavy poprvé zařazena i Mycoplasma pneumoniae, jako významný patogen akutních respiračních onemocnění (ARO) s těžším klinickým průběhem.
U vzorků sér požadujeme stanovení titru protilátek metodou vazby komplementu (KFR), což nepovažujeme za samoúčelné, protože tato metoda je základním postupem sérologického vyšetřování párových sér, na jejichž pozitivních výsledcích je postaveno hlášení ARO (zejména u nechřipkových respiračních virů a Mycoplasma pneumoniae, u chřipky pak společně s testem inhibice hemaglutinace - HIT).
KFR je metoda specifická, citlivá, levná, nenáročná na technické vybavení laboratoře a potřebná diagnostika jsou lehce dostupná v různých komerčních firmách. Metoda umožňuje testování většího počtu sér s několika antigeny současně a výsledky vyšetření párových sér jsou snadno interpretovatelné.
Na několika pracovištích účastnících se EHK se KFR nepoužívá a séra jsou zde vyšetřována jen metodou ELISA. I tento test má v diagnostice své místo, ale pro účely vyšetřování ARO je zbytečně drahý a navíc pouze kvalitativní výsledky nelze zodpovědně zinterpretovat ve vztahu ke stávajícímu onemocnění. Ani doplňkové vyšetření IgM protilátek, jejichž vzestup (pokud se nejedná o primoinfekci) nastupuje téměř současně se vzestupem IgG protilátek a jejichž hladina setrvává také poměrně dlouho, neumožní u ARO odvodit závěr se spolehlivou výpovědní hodnotou.
Jak všichni dobře víme, negativní výsledek při vyšetření jednoho vzorku séra neznamená, že se nejedná o rekurentní infekci (sérum odebrané v akutní fázi) a zase naopak, pozitivní výsledek neznamená, že se o rekurentní infekci jedná (i měsíce přetrvávající titry protilátek). Interpretace takových výsledků je téměř nemožná a snad i proto mohou nastat případy jako ten, kdy lékařka odmítla provést chirurgický zákrok u pacientky, která měla v séru komplement fixační protilátky v titru 1:16 proti Mycoplasma pneumoniae s tím, že pacientka není zdravá. Pacientka přitom nejevila žádné příznaky respiračního infektu a nemocná byla před půl rokem.
Počet laboratoří zapojených do EHK se postupem let zvyšuje. Rozptyl procent úspěšnosti mezi jednotlivými laboratořemi je dosti značný a přestože zatím všechny laboratoře všemi EHK „prošly“, setkáváme se při hodnocení se závažnými nedostatky u některých z nich. I o výsledky těchto laboratoří se opírá hlášení ARO, a proto vítáme všechny zájemce o konzultace a stáže (v NRL pro chřipku i v NRL pro nechřipkové respirační viry), které laboratořím nabízíme k zdokonalení a sjednocení metodiky KFR.
II.
EHK - 259 Sérologie respiračních virů -
hodnocení
Vzorky byly rozeslány do 27 laboratoří, 26 laboratoří zaslalo své protokoly zpět.
Zásilka obsahovala 4 vzorky neředěných inaktivovaných sér o objemu 0,4 ml, třem laboratořím, které požadovaly větší objem vzorků do automatických systémů, bylo zasláno po 1 ml séra. Vzorky připravila sérologická laboratoř odborné skupiny vzdušných nákaz virového původu.
Úkolem laboratoří bylo stanovit titry protilátek metodou vazby komplementu (KFR) u 5 následujících antigenů: influenza A(H1N1), A(H3N2), influenza B, adenovirus (AV), Mycoplasma pneumoniae (MP).
15 laboratoří bylo schopno vyšetřit vzorky v KFR se všemi antigeny, 2 laboratoře neprovádějí vyšetření M.pneumoniae v KFR a 6 laboratoří nevyšetřuje influenzu A subtypově.
3 laboratoře zpracovaly vzorky metodou ELISA, z toho pak 1 laboratoř vyšetřila vzorky pouze na M.pneumoniae.
Hodnocení bylo provedeno následovně:
výsledek shodný s výsledkem NRL 2 body
posun o 1 ředění (±) 1 bod
nesprávný výsledek 0 bodů
Podle počtu vyšetřovaných antigenů mohly
laboratoře získat maximálně 40 bodů, respektivě 32 bodů u laboratoří, které
nevyšetřují všechny antigeny.
Správné výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 a 2.
Č. vzorku |
Titry protilátek v KFR |
||||||||
A(H1N1) |
A(H3N2) |
B |
AV |
MP |
|||||
1 |
<8 |
<8 |
<8 |
<8 |
512 |
||||
2 |
<8 |
8 |
8 |
32 |
<8 |
||||
3 |
<8 |
<8 |
<8 |
<8 |
<8 |
||||
4 |
512 |
256 |
<8 |
16 |
<8 |
||||
Maximum bodů |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
||||
Æ
získaných bodů |
5,5 |
6,1 |
5,91 |
6,04 |
6,38 |
||||
Tabulka 2: správné výsledky (ELISA)
|
|||||||||
Č. vzorku |
IgG protilátky (titry
v ELISA) |
Kvalitativně |
|||||||
A |
B |
AV |
MP (IgM) |
||||||
1 |
800 |
1600 |
1600 |
+ |
|||||
2 |
800 |
1600 |
6400 |
- |
|||||
3 |
<100 |
<100 |
<100 |
- |
|||||
4 |
>12800 |
1600 |
3200 |
- |
|||||
Pro hodnocení byly laboratoře rozděleny do 4 skupin podle
metody a počtu vyšetřovaných antigenů – viz tabulka
3.
I. SKUPINA METODA VAZBY KOMPLEMENTU 5 ANTIGENů 15
laboratoří - maximum bodů 40 |
||
Počet
dosažených bodů |
Počet
laboratoří |
% úspěšnosti |
35 |
2 |
87,5 |
34 |
1 |
85,0 |
33 |
2 |
82,5 |
32 |
1 |
80,0 |
31 |
2 |
77,5 |
29 |
2 |
72,5 |
28 |
2 |
70,0 |
27 |
1 |
67,5 |
23 |
2 |
57,5 |
II. SKUPINA METODA VAZBY
KOMPLEMENTU 4 ANTIGENY (2x bez MP, 6x bez subtypů chřipky A) 8
laboratoří - maximum bodů 32 |
||
Počet
dosažených bodů |
Počet
laboratoří |
% úspěšnosti |
26 |
1 |
81,2 |
25 |
2 |
78,1 |
24 |
1 |
75,0 |
23 |
2 |
71,87 |
22 |
1 |
68,75 |
21 |
1 |
65,6 |
III. SKUPINA METODA ELISA 4 ANTIGENY 2
laboratoře - maximum bodů 32 |
||
Počet
dosažených bodů |
Počet
laboratoří |
% úspěšnosti |
32 |
2 |
100 |
IV. SKUPINA METODA ELISA 1 ANTIGEN (MP) 1
laboratoř - maximum bodů 16 |
||
Počet
dosažených bodů |
Počet
laboratoří |
% úspěšnosti |
12 |
1 |
75 |
Hodnocení laboratoří je shrnuto v tabulce č.4.
SKUPINA |
LIMIT |
I. |
39,30 |
II. |
38,76 |
III. |
52,50 |
IV. |
39,38 |
Titry vzorku č.1 (výsledek NRL 1:512):
výsledky 5 laboratoří
1 : 256
1 : 256
1 : 128
1 : 128
< 1 : 8
!
Titry vzorku č.4 (výsledek NRL 1:512): výsledky 1 laboratoře
< 1 : 8 !
CF antigen A Virion (šarže neuvedena)
Titry vzorku č.4 (výsledek NRL 1 : 512): výsledky 1 laboratoře
1 : 16 !
CF antigen MP Imuna (č.š. 920297)
Titry vzorku č.4 (výsledek NRL < 1 : 8): výsledky 1 laboratoře
> 1 : 128 !
Podle těchto výsledků je patrné, jak důležité je mít systém metody vazby komplementu dobře vyvážený.
Metoda vazby komplementu - KFR
Používáme
nejvyšší ředění komplementu, u něhož 2 jednotky a 1 jednotka vykazují kompletní
hemolýzu a 0,5 jednotky a 0,25 jednotky mají úplnou zábranu hemolýzy (kontroly
jednotek komplementu -
- 4 4 ) viz tabulka 5.
KONTROLY JEDNOTEK KOMPLEMENTU |
VÝŠE
TITRů SÉR |
||||||
Ředění komplementu |
2 j |
1 j |
1/2 j |
1/4 j |
a |
b |
c |
1:20 |
- |
- |
4 |
4 |
64 |
8 |
16 |
1:25 |
- |
- |
4 |
4 |
128 |
16 |
32 |
1:30 |
- |
- |
4 |
4 |
256 |
32 |
32 |
|
hemolýza |
sedimentované krvinky |
|
|
|
Všechny laboratoře překročily požadované limity a úspěšně absolvovaly EHK s omezením podle spektra vyšetřovaných antigenů a metod. Z tabulky 1 vyplývá, že v diagnostice jednotlivých agens nejsou výrazné rozdíly.
Vzhledem k nízké výpovědní hodnotě získaných výsledků by vyšetřování sér na respirační viry metodou ELISA nemělo být jedinou sérologickou metodou používanou v laboratořích. Protilátky v těle pacienta přetrvávají poměrně dlouhou dobu (i několik měsíců u IgG a do 1 měsíce u IgM) a jejich přítomnost v séru pacienta nemusí nutně mít etiologickou souvislost s rekurentním onemocněním. Samotný výsledek přítomnosti protilátek v séru pacienta může být zavádějící a měl by být v tomto smyslu interpretován.
III. EHK
Sérologie respiračních virů - celkové hodnocení posledních šesti let
(1996 - 2001)
Hodnocení Externího hodnocení kvality – sérologie respiračních virů za léta 1996 – 2001 je shrnuto v tabulkách 6 a 7.
Tabulka 6: Celkové
hodnocení EHK sérologie resp.virů
1996-2001 |
||||
Číslo EHK |
Počet hodnocených |
Max. počet |
% úspěšnosti |
Rozmezí |
|
laboratoří |
bodů |
|
% úspěšnosti |
65/96 |
19 |
26 |
79,91% |
96,15
– 57,69% |
91/97 |
18 |
40 |
80,62% |
92,5
– 65% |
133/98 |
22 |
40 |
75,53% |
95
– 50% |
173/99 |
19 |
40 |
91,25% |
97,5
– 85% |
216/00 |
19 |
32 |
70,56% |
96,88
– 34,38% |
259/01 |
26 |
40 |
74,70% |
87,5
– 57,5% |
KÓDY č. :
371 38 209 344
20
44 316 39 365 13
MUDr.Radomíra Limberková
RNDr.Marie Otavová