Průkaz virionů z čeledi Herpesviridae ve vezikulární tekutině
![]()
V příspěvku je stručně popsána metoda přímé elektronové
mikroskopie, která se v naší NRL používá v diagnostice virových infekcí. Touto
metodou byla vyšetřována vezikulární
tekutina, transportní medium s vezikulární tekutinou a sérum pacienta s
atypickou vezikulární dermatitidou, pro vyloučení pravých neštovic. Ve
všech třech vyšetřovaných vzorcích byly prokázány četné viry čeledi Herpesviridae
- viry varicella zoster - vyvolávající
plané neštovice.
Elektronovou
mikroskopii řadíme ve virologické diagnostice mezi rychlé postupy
schopné poskytnout výsledek během několika hodin od získání klinického
materiálu. Viry mohou být detekovány buď přímo (přímá metoda elektronové
mikroskopie = EM) nebo po inkubaci
s antiséry, případně monoklonálními protilátkami (imunoelektronová
mikroskopie = IEM) [1, 2]. V naší laboratoři
jsme se od roku 1995 soustředili především na využití elektronové mikroskopie v
diagnostice virových infekcí. Účastníme se dvakrát do roka Externího hodnocení
kvality, které organizuje Kochův Institut v Berlíně v okruhu „EM Virus
Diagnostics“. Naše laboratoř je členem adresáře "Directory of Microscope
facilities“, který rovněž zaštíťuje
Kochův Institut ve spolupráci s kanadskými a dalšími organizacemi.
Princip metody přímé elektronové mikroskopie (EM)
Princip metody přímé elektronové mikroskopie (EM) spočívá v zalití virových partikulí do amorfního elektrondensního barviva (v našem případě 2% uranyl acetát a 2% molybdenan amonný). Negativní barvivo vytváří temné pozadí, v němž se jednotlivé partikule, díky nižší schopnosti rozptylovat elektrony, jeví jako světlé částice. Barvivo přitom pronikne do povrchových nerovností virových partikulí a umožní tak vizualizaci substrukturálních detailů až do velikosti 2 nm. V současné době je známo více než 30 000 různých druhů virů. Jsou klasifikovány podle genomových vlastností a morfologie partikulí. Morfologie rozděluje viry do 56 virových čeledí [4]. Z těchto 56 virových čeledí je 21 čeledí specifických pro lidskou populaci a 26 čeledí pro ostatní obratlovce. Viry v každé z čeledí vykazují charakteristickou morfologii, proto mohou být viry podle velikosti a jemné struktury určeny do jedné specifické čeledi.
Diagnóza založená na určení čeledí podle morfologie často splní klinikovi okamžité požadavky, ušetří čas a soubor diagnostických testů. EM není vhodná pro masový screening, proto byly a jsou vyvíjeny četné alternativní testy. Tyto alternativní testy nejsou skutečnou náhradou EM. Cílem alternativních testů je virový antigen nebo nukleová kyselina, nebo protilátky a tím se liší od EM, která prokazuje samotné virové partikule. V porovnání s alternativními metodami (PCR, ELISA) vyniká jako metoda „catch – all- method“, nepřímým „open view“ a rychlostí dovolující v klinicky kritických situacích rychle detekovat infekční agens a to nejen viry, ale i taková jako jsou bakterie, mykoplazmata a houby [1, 3, 4].
Velkou výhodou přímé elektronové mikroskopické metody pro diagnostiku je, že je tato metoda neselektivní. Prokazuje všechny viry přítomné v daném materiálu (viz obrázky 1 a 2), dále inaktivované viry, a viry pokryté protilátkami, jež mohou unikat sérologické diagnostice. Zachycuje všechny viry, které jsou obtížně kultivovatelné nebo nekultivovatelné. Viry mohou být pomocí této metody detekovány v nejrůznějším klinickém materiálu: v moči, plasmě, séru, stolici, vezikulární tekutině, mozkomíšním moku, krustách a pod.
Případ pacienta z Českých Budějovic
Od pacienta z Českých Budějovic, jehož klinický materiál nám byl kurýrem zaslán v pátek, 20. prosince 2002 (viz aktualita v tomto čísle) byla vyšetřována vezikulární tekutina, transportní medium s vezikulární tekutinou a sérum pacienta s cílem rozhodnout, zda atypická vezikulární dermatitida je vyvolána viry čel. Poxviridae a nebo viry čel. Herpesviridae. Virová suspense z těchto vzorků byla adsorbována 20 min. na elektronmikroskopických síťkách (400 mesh) potažených formvarovou blankou. Po adsorpci byly negativně obarveny 2% uranyl acetátem a 2% molybdenanem amonným. Po obarvení byly vzorky prohlíženy v elektronovém mikroskopu JEOL 100CX II. Ve všech třech vzorcích byly prokázány četné viry čel. Herpesviridae, což jsou obalené viry s nukleokapsidou kubické symetrie o průměru 50 nm, celý virion má průměr 120 až 150 nm (viz obr. 3 a 4). Prokázané viry ve vezikulární tekutině, plasmě a transportním médiu byly tedy viry varicella zoster (VZV), vyvolávající plané neštovice a pásový opar.
Virus varioly (neštovic) patří do rodu Orthopoxvirus čeledi Poxviridae. Tvar virionů připomíná cihlu se zaoblenými rohy s nepravidelným uspořádáním povrchových fibrilárních struktur o rozměrech 200 – 390 x 100 – 260 nm (obr. 5). Dalším rodem patřícím do čeledi Poxviridae je Parapoxvirus, který zahrnuje viry primárně patogenní pro skot, ovce a kozy. Jsou přenosné na člověka a vyvolávají většinou profesionální nákazy. Parapoxviry mají oválný tvar, a rozměry 226 – 300 x 140 – 170 nm, fibrily obtáčejí virion v paralelním uspořádání (obr.6). Žádný ze zmíněných virionů nebyl ve vezikulární tekutině, transportním mediu s tekutinou, ani v plasmě prokázán. Vezikulární dermatitida byla vyvolána viry varicella zoster, jednalo se tedy o plané neštovice.
OBRÁZKY
Obr. 1. Salmonella a rotaviry (šipky) v extraktu stolice (bar = 100 nm).
Obr. 2. Adenoviry a BK viry (čeleď Papovaviridae - rod Polyomavirus) (šipky) v moči (bar = 100 nm).
Obr. 3. Viry varicelly z vezikulární tekutiny z puchýřků od pacienta z Českých Budějovic, čeleď Herpesviridae (bar = 100 nm). Obalené viriony s nuklekapsidou kubické symetrie uvnitř (šipka).
Obr. 4. Spontánní komplex virů čeledi Herpesviridae – varicella v transportním médiu s vezikulární tekutinou z puchýřků od pacienta z Č.Budějovic (bar = 100 nm).
Obr. 5. Virus čeledi Poxviridae, rod Orthopoxvirus (bar = 100 nm). Cihlovitý tvar virionu se zaoblenými rohy a nepravidelným uspořádáním povrchových fibrilárních struktur (šipka).
Obr.6. Virus čeledi Poxviridae, rod Parapoxvirus (bar = 100 nm). Fibrily obtáčejí oválný virion v paralelním uspořádání (šipka).
LITERATURA
[1] Miller SE, Howell DN. Concerted use of immunologic
and ultrastructural analyses in diagnostic medicine: immunoelectron microscopy
and correlative microscopy. Immunol. Invest. 1997; 26: 29 – 38.
[2] Biel SS,
Gelderblom R H. Diagnostic electron microscopy is still a timely and rewarding
method. J of Clin Virol. 1999; 13: 105 – 119.
[3] Biel S. S., Madey D. Diagnostic virology –
the need for electron microscopy: a discussion paper. Journal of Clinical Virology 2001; 22: 1- 9.
[4]
Gelderblom R.H. Electron
microscopy in diagnostic virology. BIOforum 2001; 5: 64 –67.
RNDr.
Jana Schramlová, CSc.
NRL pro přímou
diagnostiku virů, bakterií
a cizorodých
buněk v klinickém materiálu
pomocí
elektronmikroskopických metod
SZÚ - CEM