![]()
Současnou situaci tuberkulózy v České republice je možné považovat za stabilizovanou [6]. Tento příznivý stav je však do jisté míry ohrožován šířením tuberkulózy ve skupinách „sociálně problematických jedinců“, za něž je možné s určitou licencí považovat bezdomovce, ilegální migranty nebo vězně. Prezentované sdělení je věnováno problematice šíření tuberkulózy ve vězeňských zařízeních ČR. Na základě analýzy DNA metodou RFLP se podařilo prokázat, že v naší republice k přenosu infekce mezi vězni prozatím nedochází, větší význam má pravděpodobně manifestace latentní infekce v souvislosti se stresující situací, kterou uvěznění představuje.
Epidemiologické studie, věnované tuberkulóze v minulosti, spočívaly zejména ve sledování základních epidemiologických ukazatelů, jako je incidence, prevalence a specifická mortalita, ve vyhledávání nových případů aktivní tuberkulózy v okolí již určených zdrojů nákazy, nebo v detekci kožní tuberkulinové přecitlivělosti v určitých definovaných populačních jednotkách. Všechny epidemiologické studie tohoto druhu byly ovšem limitovány specifickými znaky patogeneze tuberkulózy (vysoký podíl inaparentních perzistentních infekcí v promořené populaci, dlouhodobý asymptomatický průběh některých nových onemocnění, obtížnost sledování přenosu infekce ve vakcinované populaci) .
Rovněž exaktnímu studiu vlastního mechanismu přenosu původce onemocnění bránila nemožnost spolehlivě určit konkrétní kmen M. tuberculosis vyvolávající onemocnění u konkrétního exponovaného jedince. Význam jediné doposud využitelné techniky fagotypizace byl v praxi velmi omezen nejen její technickou náročností a určitou těžkopádností, ale zvláště skutečností, že více než 80 % kmenů se řadí do jednoho fagotypu a ve většině případů proto nelze identitu cirkulujících kmenů M. tuberculosis spolehlivě prokázat [1].
Zásadní změnu do epidemiologie tuberkulózy vnášejí až molekulárně biologické metody, vycházející ze znalosti mykobakteriálního genomu. Tato nová generace metod, reprezentovaná v našich podmínkách zejména metodou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) umožňuje jednoznačnou identifikaci M. tuberculosis na poddruhové úrovni, tj. na úrovni kmenů, [2].
Nejčastěji využívaným markerem v molekulární epidemiologii tuberkulózy se stal inzerční element IS6110, repetitivní sekvence o 1355 párech bazí, která se v mykobakteriálním genomu vyskytuje obvykle v počtu do 25 kopií. Metoda RFLP je založena na analýze polymorfie restrikčních profilů mykobakteriální DNA ve vztahu k počtu a molekulové hmotnosti uvedené inzerční sekvence [3].
Podle identity, příbuznosti nebo naopak odlišnosti restrikčního profilu jednotlivých kmenů M. tuberculosis je možné jednoznačně potvrdit nebo vyloučit přenos původce onemocnění k vnímavému jedinci, nebo monitorovat lokální, rodinné, komunitní i další typy mikroepidemií, které v oblastech nízké prevalence tuberkulózy představují nový prvek v epidemiologii tohoto onemocnění [4,5].
Jednou z nejdůležitějších
aplikací RFLP je stanovení podílu různých genotypů M. tuberculosis
v různých geografických oblastech, etnických a jiných skupinách
obyvatelstva. Za jednu z „jiných
skupin obyvatelstva“ jsou právem považovány osoby ve výkonu trestu, soustředěné
ve vězeňských zařízeních ČR. Po katastrofických zprávách o šíření tuberkulózy
mezi vězni v zemích bývalého Sovětského svazu (WHO reporty) jsme se rozhodli
této problematice blíže věnovat. Cílem naší práce bylo tedy posoudit,
zda se TB mezi vězni v důsledku jejich uvěznění skutečně šíří a zda se na
výskytu tohoto onemocnění podílejí i multirezistentní kmeny M. tuberculosis.
MATERIÁL A METODY
Kmeny Mycobacterium tuberculosis byly získány ve spolupráci s Národní jednotkou dohledu nad tuberkulózou z oddělení Tuberkulózy a respiračních nemocí (TRN) nemocnice Vězeňské služby v Ostrově nad Ohří. Jednalo se celkem o 22 kmenů Mycobacterium tuberculosis izolovaných během roku 2000 ze vzorků sputa hospitalizovaných osob.
Identifikace a testy citlivosti. Identifikace kmenů byla ověřena s použitím identifikačních genových sondy AccuProbe pro M. tuberculosis complex (Gen-Probe Inc., San Diego, CA, USA). Určení lékové citlivosti na základní antituberkulotika (izoniazid, rifampicin, etambutol, streptomycin a pyrazinamid) bylo provedeno Canettiho proporčním testem v souladu s Doporučenými standardními metodami v mikrobiologii mykobakteriálních infekcí , které v roce 1998 vydala Národní referenční laboratoř pro mykobakterie SZÚ ve spolupráci s firmou Trios [8].
Analýza DNA - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) byla
provedena podle standardizované metodologie Národního ústavu veřejného zdravotnictví
a ochrany životního prostředí (Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu),
Bilthoven, Nizozemí [7]. Takto získané restrikční profily (DNA fingerprinty)
byly nejprve orientačně posouzeny vizuálně a poté, po převedení na digitální
obraz ve formátu vyžadovaném programem GelCompar (verze 3.1b, Applied Maths.,
Kortrijk, Belgie) byly pomocí tohoto softwaru vyhodnoceny. Vyhodnocení
probíhalo tak, že digitální obrazy fingerprintů byly normalizovány pomocí
obrazů referenčních kmenů a poté porovnány. Výpočet podobnosti byl proveden
podle Dicea a dendrogram byl sestaven jako typ UPGMA; porovnávala se tedy
poloha jednotlivých proužků („bandů“) v relaci ke všem ostatním vzorům.
Kmeny M. tuberculosis, v jejichž genomu je prokázán shodný počet i
umístění inzerční sekvence IS6110 jsou označeny jako klastrované.
Klastry (shluky) obsahují kmeny s naprosto identickým restrikčním
profilem, ale i kmeny geneticky pouze příbuzné, tj. s určitým procentem
podobnosti (více než 75 %). Naopak kmeny neklastrované se vyznačují unikátním
počtem kopií IS6110 s různou molekulovou hmotností a tedy i
s různou lokalizací inzerční sekvence.
Sledovaný soubor nemocných sestával celkem z 22 kmenů M. tuberculosis izolovaných z biologického materiálu hospitalizovaných vězňů v roce 2000. V 4 případech šlo o cizince, pouze ve 2 případech se jednalo o ženy. Nejvyšší výskyt onemocnění byl zjištěn ve věkové skupině 30-39 let u mužů (8 případů). Věk nemocných vězňů se pohyboval v rozpětí 24-53 let. Všechny kmeny M. tuberculosis byly citlivé na základní antituberkulotika s výjimkou jediného (šlo o kmen izolovaný z materiálu 51letého muže; tento kmen byl multirezistentní, testy citlivosti byla zjištěna rezistence na izoniazid + rifampici + streptomycin + etambutol).
Restrikční profily kmenů byly určeny ve 20 případech, zbylé 2 kmeny nenarostly v subkulturách, tj. nebylo zde možné provést izolaci DNA jako výchozí a nezbytný krok celé metody RFLP .
Získané fingerprinty byly posouzeny vizuálně a poté vyhodnoceny SW GelCompar. Takto bylo prokázáno, že ve vězeňských zařízeních nedochází prozatím k šíření tuberkulózy, protože „vězeňské kmeny“ M. tuberculosis měly individuální, polymorfní restrikční profily (viz obrázek 1). V souboru byly sice nalezeny 2 klastry po 2 kmenech, ty ale neobsahovaly zcela identické kmeny, jejich similarita činila 84 resp. 92 %. Shodou okolností se v každém dvoučlenném klastru jednalo o 1 kmen izolovaný ze vzorků biologického materiálu muže a 1 kmen izolovaný z infekčního materiálu ženy – v těchto případech můžeme o eventuálním kontaktu nemocných osob pouze spekulovat.
Obrázek
1: Klastrová analýza „vězeňských“ kmenů
M. tuberculosis

Jelikož zaměstnanci a příslušníci vězeňské služby nesmějí bez souhlasu svého vedení poskytovat žádné informace, byla realizace prezentované studie obtížná. Kromě toho bylo nutné vzít v potaz skutečnost, že tzv. obvinění (ve vazbě) a odsouzení (v trestu) chovanci věznic neodpovídají národnostní, pohlavní ani věkovou skladbou běžné populaci České republiky.
Přes uvedená omezení je zřejmé, že se nám podařilo dospět k pozitivním, nebo, lépe řečeno, optimistickým závěrům: při uvěznění jednoho z nemocných s multirezistentní tuberkulózou nedošlo k prokazatelnému infikovaní dalších vězňů, pro což svědčily nálezy citlivých kmenů M. tuberculosis s individuálními, neklastrovanými RFLP profily. Jednoznačně bylo prokázáno, že ve vězeňských zařízeních České republiky doposud nedochází k šíření tuberkulózy. Více pravděpodobná je manifestace latentního onemocnění tuberkulózou v souvislosti s uvězněním. Nicméně případy šíření tuberkulózy ve vězeňských zařízeních není možné v budoucnosti vyloučit - proto jsme rozhodnuti se této problematice nadále systematicky věnovat.
1) Hynčicová I. Molekulární epidemiologie tuberkulózy. Souborný referát. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol 1998; 47(2): 68-71.
2) van Soolingen, D.: Utility of molecular epidemiology of tuberculosis. Eur resp J. 1998; 11: 1-3.
3) van Soolingen, D., Hermans, P.W.M., de Haas, P.E.W., Soll, D.R., van Embden, J.D.A.: The occurence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: evaluation of IS-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J. Clin. Microbiol 1991; 29: 2578-2586.
4) Kremer,K., van Soolingen, D., Půtová, I., Kubín, M.: Use of IS6110 fingerprinting in tracing man-to-man transmission of Mycobacterium tuberculosis in the Czech Republic. Centr Europ J Publ Hlth 1996; 4: 3-6.
5) Rigouts, L., Kubín, M., Havelková, M., Portaels, F.: DNA fingerprint analysis of drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in the Czech Republic. Centr Europ J Publ Hlth 1994; 2: 58-59.
6) Havelková,
M. et al.: Výroční zpráva o mykobakteriologické diagnostice v České
republice 1992, 1993, 1994, 1995, 1996, 1997. Příloha 5/93, 4/94, 5/95, 4/96,
4/97, 9/98 k Acta HEM, SZÚ, Praha.
7) van Embden, J.D.A., Cave, M.D., Crawford, J.T., Dale, J.W.: Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting. Recommendations for a standard methodology. J Clin Microbiol 1993; 31: 406-409.
8) Kolektiv autorů: Doporučené standardní metody v mikrobiologii mykobakteriálních infekcí. NRL pro mykobakterie, SZÚ Praha, 1998.
MUDr. Marta Havelková,CSc.,
MUDr. Vladimír Príkazský, CSc.,
Doc. MUDr. Luděk Trnka, DrSc.,
Národní jednotka dohledu nad tuberkulózou, Ústav
pneumologie
a hrudní chirurgie, FN Bulovka
MUDr. František Krejbich,
Národní jednotka dohledu nad tuberkulózou, Ústav
pneumologie
a hrudní chirurgie, FN Bulovka