Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2003; 12(3):126-128.

 

Hypervirulentní klonální uskupení Neisseria meningitidis v České republice v roce 2002

 

 

Martin Musílek, Pavla Křížová

 

Souhrn

V České republice trvá významné zastoupení kmenů hypervirulentních uskupení u izolátů z invazivního meningokokového onemocnění (68% v r. 2002). Zaznamenán byl nárůst zastoupení zejména u komplexu ET-5 (ST-32) meningokoků sérologické skupiny B a opětovně u komplexu ET-37 (ST-11) meningokoků sérologické skupiny C. U izolátů komplexu ET-37 trvale převažuje klonální varianta ET-15, pokračuje též výskyt varianty 2, zjišťovaný od r. 2001 v severních a východních Čechách. Vzhledem k fenotypové proměnlivosti hypervirulentních kmenů je při epidemiologickém hodnocení případů meningokokového onemocnění účelné přihlížet k výsledkům multilokusové typizace.

 

 

Předchozí rozbor [1] přiblížil členění meningokokové populace do epidemiologicky významných hypervirulentních klonálních uskupení (komplexů), označovaných též uskupení hyperinvazivní. Rozbor shrnul rozšíření dominantních hypervirulentních uskupení a problematiku jejich charakterizace. Účelem předkládané informace je aktualizace poznatků, souvisejících s klonální charakterizací tuzemské populace Neisseria meningitidis.

 

Hypervirulentní uskupení N. meningitidis

Kolonizace hypervirulentním kmenem je významným předpokladem rozvoje invazivního meningokokového onemocnění (IMO), hypervirulentní kmeny jsou izolovány převážně z invazivních forem infekce, s nízkou četností od asymptomatických nosičů. Hypervirulentní uskupení jsou typicky odpovědná za ohniskový výskyt IMO. Onemocnění, působená kmeny hypervirulentních uskupení, vykazují zpravidla specificky závažnější průběh a zvýšenou smrtnost.

Při regionálním i lokálním epidemiologickém hodnocení případů IMO a sledování kontaktních osob je účelné mít na zřeteli údaj o povaze izolátů, umožňující rozpoznat šíření hypervirulentního kmene. Kromě celkového hodnocení vývoje situace IMO v ČR informuje Národní referenční laboratoř pro meningokokové nákazy CEM SZÚ (NRL) průběžně mikrobiology a epidemiology o povaze izolátů N. meningitidis zasílaných k bližší identifikaci. Vzhledem k fenotypové proměnlivosti kmenů, šířících se v ČR, byla od r. 2002 informace o imunochemickém fenotypu rozšířena informací o hypervirulentní povaze a o klonálním zařazení izolátů, zjištěném vysoce průkazným přístupem multilokusové typizace.

Pro stanovení klonální příslušnosti izolátů NRL užívá přístup multilokusové enzymové elektroforézy (MLEE), pokusně s perspektivou širšího využití přístup multilokusové sekvenční typizace (MLST). Na základě stanovení elektroforetického typu (ET), resp. sekvenčního typu (ST) multilokusové přístupy člení izoláty do klonálních uskupení - ET komplexů, resp. ST komplexů. Jednotlivá hypervirulentní i slabě virulentní uskupení lze pojmenovat rovnocenně dle MLEE a MLST nomenklatury (např. komplex ET-37, značený dle MLEE, odpovídá komplexu ST-11, značenému dle MLST). Výjimečným je z tohoto pohledu prostřednictvím MLST široce vymezený komplex ST-44, sdružující subpopulace, odlišené dle povahy MLEE nomenklaturou - hypervirulentní (uskupení III) i slabě virulentní (např. uskupení IV); v loňském roce nově přijaté označení tohoto komplexu (ST-44) nahradilo v MLST nomenklatuře původní označení (ST-41), užité v předchozím rozboru.

 

Zastoupení hypervirulentních uskupení N. meningitidis v České republice

V r. 2002 byl v ČR po několikaletém poklesu zaznamenán opět nárůst relativní četnosti IMO, působeného globálně se šířícím hypervirulentním komplexem ET-37 (komplex ST-11 dle MLST). Většina izolátů komplexu ET-37, jenž se v ČR rozšířil hyperendemicky po r. 1993, náleží každoročně ke klonální variantě ET-15 (80% v r. 2002), vykazující nejběžněji fenotyp C:2a:P1.5,2 či C:2a:P1.2. Varianta komplexu ET-37, vykazující sérologickou skupinu B a vyskytující se v ČR s nízkou četností, byla v r. 2002 zjištěna u jednoho případu IMO (fenotyp izolátu B:2a:P1.5,2, klonální varianta ET-15).

Šestinu invazivních izolátů komplexu ET-37, vyšetřených NRL v r. 2002, tvořila varianta 2, blízká variantě ET-15. Varianta 2 komplexu ET-37 je zjišťována od r. 2001 dosud výlučně u izolátů, zachycených laboratořemi Ústeckého, Pardubického a Královéhradeckého kraje. Izoláty varianty 2 komplexu ET-37 vykazovaly fenotyp s nevyjádřeným sérotypem - C:NT:P1.5,2, v menší míře C:NT:NST. Varianta 2 komplexu ET-37 byla dosud (březen 2003) izolována z celkem 12 případů IMO včetně 3 případů úmrtí, nikoliv od asymptomatických nosičů. Kromě varianty ET-15 a varianty 2 bylo u tuzemských izolátů komplexu ET-37 dosud zjištěno dalších 12 klonálních variant, vyskytujících se však ojediněle. Rozšíření hypervirulentních uskupení N. meningitidis v ČR v letech 1993-2002 uvádí graf.

Souběžně s postupující změnou rozložení séroskupin tuzemské meningokokové populace, chrarakterizovanou nárůstem výskytu kmenů sérologické skupiny B, proti níž není dostupná očkovací látka, bylo v r. 2002 u vyšetřených izolátů z IMO zjištěno rostoucí relativní zastoupení globálně se šířícího hypervirulentního komplexu ET-5 (komplex ST-32 dle MLST). Tři čtvrtiny invazivních izolátů komplexu ET-5, vyšetřených NRL v r. 2002, tvořila klonální varianta 1 (u tuzemských izolátů komplexu bylo dosud zjištěno celkem 8 klonálních variant).

Izoláty komplexu ET-5 vykazovaly většinou fenotyp B:4:P1.15, v menší míře pak B:15:P1.7(P1.16). Přesto, že fenotyp B:4:P1.15 je u izolátů komplexu v našich podmínkách běžný, je typický rovněž pro izoláty jiných, slabě virulentních uskupení, nalézaných zejména u asymptomatických nosičů. V závěru roku byla v Pardubickém kraji sledována situace, kdy přes shodný fenotyp B:4:P1.15, zjištěný u izolátů od pacienta s IMO a od dvou kultivačně pozitivních kontaktních osob, multilokusová typizace prokázala klonální odlišnost izolátů. Invazivní izolát příslušel k hypervirulentnímu komplexu ET-5, zatímco izoláty od kontaktů náležely ke slabě virulentnímu uskupení IV. Pracovníky NRL potěšilo, že se i tyto detailní a epidemiologicky důležité charakteristiky začínají objevovat v komentářích některých epidemiologů [2].

Šíření komplexu ET-5 v ČR nejeví v celku geografickou souvislost. Výjimkou je opakovaná izolace specifické varianty 4 komplexu v Českobudějovickém kraji, kde v menší obci meningokok této varianty způsobil enormně vysokou nemocnoct IMO [3]. Přesto, že izoláty varianty 4 zde vykazovaly dílčí odlišnost fenotypu (B:4:P1.15, B:4:P1.16), užší epidemiologickou vazbu prokázala multilokusová typizace a srovnávací chromozomální analýza DNA pomocí elektroforézy v pulzním poli. U komplexu ET-5 lze vzhledem k rozšíření v západoevropských státech a ke stálému nárůstu četnosti nálezu u případů IMO v ČR předpokládat zvýšený epidemiologický význam i v dalším období.

Pokles zaznamenala v r. 2002 četnost IMO, působená hypervirulentním komplexem 22 (komplex ST-18 dle MLST), rozšířeném ve státech bývalého Východního bloku a významně zastoupeném v ČR v minulém období. Posouzení rozsahu dalšího šíření komplexu 22 je, podobně jako u komplexu ET-37, z pohledu předchozího dlouhodobějšího vývoje a změn sledovaných v r. 2002 nesnadné.

Kromě uvedených hypervirulentních uskupení pokračoval v r. 2002 výskyt uskupení, vykazujících v podmínkách ČR hypervirulentní povahu, avšak vyskytujících se zde průběžně s nižší četností - uskupení “Y“ (komplex ST-269 dle MLST), vykazujícího fenotyp B:15,23:P1.5 a nalézaného zejména ve Velké Británii, uskupení A3 (značené původně též “W“, komplex ST-23 dle MLST), vykazujícího většinou sérologickou skupinu Y či W135 v kombinaci se sérotypem 2c či 14 a nalézaného v USA i západní Evropě, či uskupení III (součást komplexu ST-44 dle MLST), vykazujícího sérologickou skupinu B v kombinacích se sérotypem 4, 15 či 1 a sérosubtypem P1.4, P1.6 či P1.13.

Současná epidemiologická situace IMO v ČR souvisí s pozvolnými změnami klonální struktury meningokokové populace. Přes měnící se zastoupení hypervirulentních klonálních uskupení N. meningitidis nedochází v ČR k hyperendemickému nárůstu četnosti onemocnění, vztaženého k některému z těchto uskupení. V souladu s pokračujícím významným výskytem hypervirulentní povahy u izolátů z IMO (68% v r. 2002) přetrvává celkově zvýšená závažnost klinického průběhu IMO s vysokou smrtností (16,4%).

 

Hlášení výsledků multilokusové typizace N. meningitidis

Na základě určení pouze fenotypu je často obtížné interpretovat povahu tuzemských hypervirulentních izolátů, zejména pro značnou fenotypovou proměnlivost a významný výskyt imunochemicky nevyjádřeného sérotypu či subtypu (izoláty netypovatelné či nesubtypovatelné, NT, resp. NST). S ohledem na účelnost i pozitivní ohlas na sdělování výsledků poskytuje NRL průběžně mikrobiologům informaci o hypervirulentní povaze zaslaných invazivních kmenů a o jejich shodě, resp. odlišnosti, vůči kmenům od kontaktních osob. S ohledem na praktický význam a režim činnosti NRL je výsledek vyšetření hypervirulentní povahy vzorků multilokusovou typizací laboratořím poskytován takto:

standardně, bez zvláštního požadavku na multilokusové vyšetření (za předpokladu, že anamnéza či epidemiologický vztah je patrný z průvodní dokumentace vzorku):

izoláty z IMO (meningitida, septikémie, Waterhouse-Friderichsenův syndrom)

izoláty od osob se zřejmým epidemiologickým vztahem s pacientem (kontaktní osoby)

izoláty od asymptomatických osob s možným epidemiologickým vztahem s pacientem či meningokokovou infekcí (osoby v ohnisku, resp. v epidemiologicky vymezené oblasti nákazy - školní či jiné kolektivy)

pouze při vyjádření požadavku na multilokusové vyšetření:

izoláty z neinvazivních forem infekce od osob bez patrného epidemiologického vztahu (asymptomatické nosičství, lokalizované infekce horních a dolních dýchacích cest, atypické meningokokové infekce)

Základní formou hlášení výsledku multilokusového vyšetření je zaslání výsledkového protokolu zadavatelské mikrobiologické laboratoři, doplňkovou formou možnost vyžádaného telefonického sdělení výsledku bezprostředně po ukončení typizace.

 

Imunochemická fenotypizace a multilokusová typizace jsou v NRL prováděny souběžně z téže zaslané laboratorní kultury. Pro odlišné postavení metodik z pohledu akreditace je laboratořím vždy po ukončení příslušné analýzy zaslán odděleně protokol o imunochemické fenotypizaci a protokol o multilokusovém vyšetření izolátu, při průkazu hypervirulentní povahy informující o druhu uskupení s případnou poznámkou o klonální variantě či o specifickém místním rozšíření. Identifikační prvky izolátu (evidenční číslo dle zadavatele, dle NRL) jsou u obou protokolů shodné. Výsledky multilokusové typizace jsou laboratořím poskytovány v rámci bezplatné spolupráce. Je žádoucí, aby výsledky multilokusové typizace byly mikrobiologickými laboratořemi postupovány příslušným epidemiologům, podobně jako je praxí při sdílení výsledků imunochemické typizace.

 

Pracovníci NRL uvítají diskusi o jednotlivých epidemiologických situacích a doufají, že poskytování upřesněných údajů o povaze meningokokových izolátů za stavu pokračujícího výskytu zvýšeně závažných forem onemocnění usnadní epidemiologickou hodnotitelnost případů IMO i ohnisek výskytu virulentního kmene.

 

Klonální charakterizace izolátů byla zčásti podpořena projekty IGA MZ ČR reg. č. NI/6882-3, NI/7109-3 a NJ/7458-3.

 

Literatura

[1]   Musílek M, Křížová P. Změny v zastoupení hypervirulentních klonálních uskupení Neisseria meningitidis v České republice v období 1993-2001. Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2002; 11(2):75-80. Dostupné též na www.szu.cz/cem/zpravy/zpr0202/meni.htm.

[2]   Hlášení o epidemiologické situaci v České republice. Komentáře podle měsíčních hlášení KHS v období 45.-48. týdne - zpracovala Křivonožková J. Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2003; 12(1):1-13.

[3]   Balejová M, Křížová P, Musílek M, et al. Výskyt meningokokových invazivních onemocnění v Dolním Bukovsku. Seminář SLM ČLS JEP Identifikace mikroorganismů a původci mikrobiálních onemocnění, Lékařský dům, Praha, březen 2003.

 

RNDr. Martin Musílek

MUDr. Pavla Křížová, CSc.

NRL pro meningokokové nákazy, SZÚ-CEM

 

 

 

Graf: Zastoupení dominantních hypervirulentních uskupení N. meningitidis, Česká republika, 1993-2002