Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2003; 12(4):171-174.

 

 

Exfoliatiny Staphylococcus aureus – původci epidermolytických infekcí

Vladislava Růžičková, Petr Petráš

 

Souhrn

Exfoliatin (ET) je stafylokokový exoprotein zodpovědný za většinu epidermolytických infekcí, zejména u novorozenců a dospělých jedinců s poškozenými ledvinami nebo se sníženou imunitou. Je produkován přibližně pěti procenty humánních kmenů S. aureus. Kmeny jsou obvykle izolovány od pacientů postižených některou z  forem epidermolýzy.   Dosud byly u S. aureus identifikovány a charakterizovány čtyři typy exfoliatinů ETA, ETB, ETC a ETD. Nejčastějšími původci lidských epidermolýz jsou však ETA a ETB. V tomto článku jsou popsány obecné charakteristiky exfoliatinů a jejich genetických determinant, dále přehled PFGE-subtypů vybraných ET-pozitivních kmenů S. aureus, které se podílely na vyvolání několika hromadných výskytů epidermolytických infekcí v České republice v letech 1998 - 2002.

 

Stafylokoky se v lidské populaci vyskytují pravděpodobně již od počátku její existence. Původně komenzální vztah bakterií tvořících součást běžné mikroflory těla a hostitele doznal během koevoluce zásadních změn, kdy se úspěšný stafylokok stal nebezpečným patogenem a je častou příčinou nozokomiálních infekcí zejména u pacientů v pooperačním stavu nebo u novorozenců. Přestože se v patogenezi infekčních nemocí lidí a zvířat uplatňují i jiné druhy stafylokoků (dosud je rozlišeno celkem 47 druhů a poddruhů), S. aureus má stále prominentní postavení v epidemiologických přehledech stafylokokových infekcí a intoxikací. Virulence S. aureus je způsobena schopností většiny jeho kmenů produkovat velké množství biologicky aktivních proteinů, které se dělí do těchto tří funkčních kategorií. Jsou to: (1) adhezivní faktory (2) propagační a transportní faktory (3) ochranné faktory a toxiny. Do první skupiny faktorů virulence patří tradiční plasmakoaguláza, „clumping“(shlukovací) faktor a několik produktů polysacharidové podstaty, obvykle označovaných jako sliz. Z druhé skupiny faktorů virulence, které umožňují stafylokokům především průnik do tkání pacienta, jsou nejznámější hemolyziny (ad). Toxické exoproteiny ze třetí skupiny faktorů virulence chrání stafylokoky před obrannými mechanismy pacienta, jako je např. Panton-Valentin leukocidin (PVL), anebo jsou původci různých forem toxikóz. Jsou to např. enterotoxiny ( A - E a G – J), toxin Syndromu toxického šoku (TSST-1) a exfoliativní toxiny A a B a [1]. produkční schopnost je individuální, jednotlivé kultury mohou tvořit extracelulární proteiny v různém rozsahu, což souvisí zejména s tím, mají-li jednotlivé kmeny ve svém genomu přítomny toxické geny a podpůrné regulační systémy (viz dále).

 

Exfoliativní toxin (ET), nazývaný též exfoliatin, je exotoxin způsobující kožní infekce u člověka a některých zvířat. Toxická epidermolýza je onemocnění, vyskytující se převážně u dětí do 10 let. V nejmírnější podobě dojde k výsevu skarlatiniformního exantému bez následné deskvamace.  V další  formě, tzv. pemphigus neonatorum, dochází k výsevu kožních puchýřků, které se poměrně brzy po antibiotické terapii dobře hojí. Syndrom opařené kůže, nazývaný též „Staphylococcal Scalded Skin Syndrom“ (SSSS), je pak plně rozvinutou, generalizovanou formou onemocnění, projevující se tvorbou puchýřů, rozsáhlých erozí a odlupováním povrchových vrstev pokožky [2]. Cílovým místem účinku ET je stratum granulosum. Bylo zjištěno, že ET nemají tropismus k jiným buňkám a nevážou se na žádné další orgány. Lokalizovaná forma epidermolytických infekcí je známá jako bulózní impetigo a vyskytuje se spíše u starších dětí nebo u dospělých.

 

SSSS je nutné léčit antibiotiky podle antibiogramu daného kmene. Podobné klinické příznaky má toxická epidermální nekrolýza – Lyellova nemoc, která je vyvolaná léky a při které se antibiotika k terapii nepoužívají. Bohužel v různých literárních zdrojích není v tomto jasno, některé dermatologické a infektologické - učebnice, uvádějí i Lyellův syndrom stafylokokového původu. 

 

V případě výskytu generalizované formy SSSS s rozsáhlými lézemi je vždy nutné věnovat zvláštní pozornost postižené pokožce, aby se zabránilo superinfekci, která při neléčení nebo nesprávném léčebném postupu může způsobit i smrt. Přestože se SSSS primárně vyskytuje u novorozenců, může se však také objevit u dospělých, zvláště u starších osob, trpících nedostatečnou funkcí ledvin, nebo majících oslabený imunitní systém. Některé další projevy SSSS, jako je zvýšená teplota a šok naznačují, že exfoliatiny mají také vlastnosti superantigenů.

 

Exfoliativní toxiny a jejich genetické determinanty

 

Exfoliatiny jsou produkovány kmeny S. aureus vyskytujícími se přibližně u pěti procent lidských izolátů [3]. Produkce a sekrece toxinu je nejvyšší v postexponenciální fázi růstu bakterií, avšak ukázalo se, že ET nemají esenciální význam pro vlastní růst a množení buněk. Lidské epidermolýzy jsou nejčastěji způsobeny dvěma sérotypy exfoliatinů A (ETA) a B (ETB) [2]. Toxin ETA je tvořen 242 aminokyselinami a ETB 246 aminokyselinami a mají molekulovou hmotnost přibližně 27000. Oba tyto sérotypy jsou navzájem antigenně odlišné a liší se též odolností ke zvýšené teplotě. ETB je tepelně labilní, kdežto ETA si zachovává svou funkci i po třicetiminutovém zahřátí na 60°C [2]. Oba toxiny se však vyznačují shodnými biologickými a patofyziologickými vlastnostmi, což bylo potvrzeno experimenty provedených na novorozených myškách. Histologické studie s použitím kultury lidských keratinocytů in vitro prokázaly tvorbu malých vezikul mezi buňkami a následné vytváření tekutinou vyplněných prostorů v granulospinózových spojeních. Nedochází však k degradaci buněk ani k cytolýze nebo nekrolýze. Biologická aktivita ETA a ETB je prakticky histologicky nerozlišitelná. Jejich účinky jsou druhově specifické, působí na lidi, opice a myši, ale nikoliv na krysy, králíky, morčata a kuřata [2]. Přibližně 31 – 41 % et-produkujících kmenů S. aureus je citlivých k fágům lytické skupiny II (nejčastěji k fágům 71 a 55/71), zatímco ostatní jsou netypovatelné [2]. Některé kmeny mohou produkovat oba sérotypy současně, jiné tvoří buď jenom ETA nebo ETB. Lékařské studie naznačují, že kmeny produkující ETB jsou agresivnější, obvykle způsobují generalizovaný SSSS [2]. Zajímavá je geografická distribuce jednotlivých ET sérotypů. Na americkém a evropském kontinentu jsou častěji nacházeny kmeny se simultánní produkcí ETA a ETB, nebo převažuje tvorba ETA, zatímco v Japonsku převažuje výskyt ETB producentů [2].

 

Genetické determinanty exfoliatinů jsou lokalizovány na různých místech genomu a jsou často asociovány s mobilními genetickými elementy jako jsou například bakteriofágy, plazmidy a ostrovy patogenity, což jsou velké DNA oblasti o velikosti 10 až 200 kb, obsahující virulentní geny a často se od ostatních chromozomových sekvencí lišící obsahem GC. Termín „ostrov patogenity“ byl poprvé použit při popisu velkých chromozomálních segmentů obsahujících virulentní geny u uropatogenního kmene Escherichia coli [4]. gen eta kódující exfoliatin A je lokalizován na chromozomu a jak se v poslední době ukazuje, je součástí genomu profága, patřícího nejčastěji do sérologické skupiny B. Důkazem toho je navození lyzogenní konverze takovýmto fágem u ET-negativního kmene S. aureus [5]. Gen etb kódující exfoliatin B je umístěn na 42kb plasmidu pRW001 spolu s geny pro rezistenci ke kadmiu, dále pro bakteriocin a geny pro bakteriocinový ochranný faktor [1]. Jsou známé kompletní sekvence obou genů a jejich vzájemná sekvenční homologie je 40 % [2]. Specifické oligonukleotidové primery odvozené z nukleotidových sekvencí těchto genů jsou používány v PCR detekci ET-pozitivních kmenů S. aureus. Exprese genů eta i etb je řízena regulátorovým agr genem. Agr lokus (3,5 kb) má čtyři otevřené čtecí rámce (agrA, agrB, agrC, a agrD) jejichž exprese je závislá na hustotě buněk. Indukuje expresi extracelulárních proteinů prostřednictvím autoindučního oktapeptidu, vyštěpeného z polypeptidu produkovaného genem agrD, a suprimuje expresi povrchových a intracelulárních proteinů. Podle typů agr genů se dělí kmeny S. aureus do čtyř skupin, které se mohou lišit například rychlostí aktivace exprese. Přibližně 64 % ET-pozitivních kmenů patří do agr skupiny IV [6].

 

Sérotyp exfoliatinu C (ETC) byl zjištěn u S. aureus izolovaného z kožní eroze koně postiženého flegmónou. ETC je tepelně labilní protein, má podobné biologické vlastnosti jako lidské exfoliatiny, přestože je od nich sérologicky odlišný. Na rozdíl od ETA a ETB způsobuje SSSS u jednodenních kuřat [2]. Údaje o jeho genetických determinantách chybí.

 

Nedávno byl v Japonsku u S. aureus izolovaného z hnisavých ran člověka, identifikován nový ostrov patogenity, obsahující otevřené čtecí rámce (ORFs), podobné genům pro exfoliatin, glutamyl-endopeptidázu a EDIN-B (toxin inhibující diferenciaci epidermálních buněk), které byly navázané na geny pro fágovou rezistenci, ohraničené sekvencemi hsdM, hsdS (geny pro restrikčně modifikační systém) a IS256 elementem [7]. Protein kódovaný genem podobným ET-genu způsobil u novorozených myší odlupování, povrchové části pokožky podobně jako ETA a ETB, avšak nevyvolal epidermolýzu u jednodenních kuřat jako ETC. Vzhledem k identickému patofyziologickému mechanismu účinku a štěpení desmogleinu1 (zkr. Dsg1; desmozomální kadherin odpovídající za adhezi mezi dvěma sousedními buňkami) byl tento protein zařazen do rodiny exfoliatinů a označen jako ETD. Tento toxin je sérologicky odlišný od ETA i ETB, má sekvenci aminokyselin, vykazující homologii 40% s ETA a 59% s ETB. Zajímavé je, že klinické izoláty S. aureus produkující ETD pocházely z infekcí jiného typu než je SSSS anebo bulózní impetigo. To ukazuje na to, že ETD může hrát patogenní roli v širším spektru stafylokokových infekcí než by se dalo očekávat.

 

Toxiny s exfoliativními vlastnostmi produkují i kmeny Staphylococcus hyicus (ShET). Způsobují epidermolýzu u selat mladších jednoho měsíce, projevující se tvorbou erozí. Působí také na jednodenní kuřata, nikoliv však na starší selata a kuřata nebo na myši a morčata. Jsou rozlišeny tři sérologické skupiny ShET. Syntéza těchto epidermolytických toxinů je řízena chromozomálními a extrachromozomálními DNA elementy, avšak stejně jako u ETC S. aureus chybí podrobnější genetické analýzy [2, 8].

 

Enzymatická aktivita exfoliatinů a jejich superantigenní vlastnosti

 

Mechanismus aktivace exfoliatinů není dosud známý, je však možné, že vazba na povrch GM4 gangliosidů umožní jejich proniknutí do keratinocytů a napadení keratohyaluronových granulí. Bylo zjištěno, že ET mají funkci podobnou serinové proteáze a že mají až 25% aminokyselinovu homologii se stafylokokovou proteázou V8, a to i částečně v aktivním místě. Cílovým substrátem ET je transmembránový glykoprotein desmoglein1, který je exfoliatinem štěpen ve specifickém místě obsahujícím zbytek kyseliny glutamové 381, nacházejícím se mezi extracelulárními doménami 3 a 4 v C-terminální oblasti [2]. V důsledku štěpení desmogleinu1 a přerušení desmosomů dochází k odloučení keratinocytů v granulární buněčné vrstvě pokožky. Vytvořené trhliny se pak  naplňují tkáňovou tekutinou a dochází k tvorbě puchýřů.

 

Superantigeny (Sags) jsou bakteriální a virové proteiny, schopné navodit polyklonální aktivaci proliferace velkého množství T lymfocytů obsahujících TcR receptor. Aktivita Sags je podmíněna jejich vazbou na určité oblasti molekul MHC třídy II na povrchu antigen nabízející buňky a variabilní oblasti beta řetězce (Vb) TcR receptoru T buněk, která je však vně místa vazby konvenčních antigenů. Do skupiny superantigenů patří také některé stafylokokové exoproteiny, jako jsou například TSST-1, enterotoxiny SEA, SEB, SEC-1, SED, SEE, SEG, SEQ a exfoliatiny A a B [3]. Pokusy vyhodnotit mitogenní aktivitu ET mohou být komplikovány přítomností jiných stafylokokových superantigenů. Bylo zjištěno, že ETA i po purifikaci vykazuje mitogenní aktivitu k T lymfocytům, na rozdíl od mutant ETA, které schopnost navodit aktivaci T-buněk ztratí. Přesto si však tyto mutanty zachovaly schopnost vyvolat epidermolýzu, což znamená, že superantigenní vlastnosti exfoliatinů mají při vzniku SSSS pouze podpůrnou roli a že superantigenní a exfoliativní aktivity spolu navzájem přímo nesouvisí [9]. Některé studie dokonce superantigenní aktivitu ET zpochybňují z několika důvodů, například proto, že žádné jiné superantigeny nemají hydrolytickou aktivitu jako ET, nebo že v pokožce pacientů postižených SSSS nebylo zaznamenáno shlukování buněk RES systému. Rekombinantní exfoliatiny naklonované do E. coli také neměly mitogenní aktivitu k T-buňkám, přestože si zachovaly schopnost vyvolat příznaky SSSS u mladých myšek [11].

 

Výskyt epidermolýz a genotypizace ET-produkujících kmenů S. aureus v České republice

 

Produkci stafylokokových exfoliatinů sledujeme v NRL pro stafylokoky metodou reverzní pasivní latexové aglutinace od roku 1998. Používáme set EXT-RPLA Denka Seiken, jehož  citlivost je udávána 1-2 nanogramy exfoliatinu A, resp. B v jednom ml supernatantu. Do konce roku 2002 byla tato toxigenita zjišťována u 1404 klinických izolátů S. aureus. Celkem bylo pozitivních 83 kmenů (5,9 %). Z těch 47 (3,3 %) produkovalo ETA, 32 (2,3 %) oba typy ETA + ETB a pouze 4 kmeny produkovaly výlučně ETB. Celková četnost producentů exfoliatinů v našem souboru kmenů odpovídá v literatuře udávaným pěti procentům [3].

 

V letech 1998 až 2002 došlo v ČR k několika hromadným výskytům kožního puchýřnatého onemocnění novorozenců. První vzplanutí toxické epidermolýzy nastalo v roce 1998 na porodnicko-novorozeneckém oddělení nemocnice v Novém Jičíně (NJ) a v nemocnici Ivančice (IVA) v témž roce. Koncem roku 2001 a začátkem roku 2002 byl zaznamenán hromadný výskyt pemphigus neonatorum v nemocnici v Brně s počtem 45 postižených novorozenců [11]. Bakteriální izoláty ze všech těchto ohnisek infekce byly zaslány k fenotypizaci do NRL pro stafylokoky v Praze. Jako etiologické agens byl potvrzeny kmeny bakteriálního druhu Staphylococcus aureus subsp. aureus, jejichž společnou vlastností byla produkce exfoliatinů ETA nebo simultánní tvorba ETA a ETB. Některé kmeny navíc tvořily enterotoxiny a toxin TSST-1. Všechny ET kmeny byly citlivé k oxacilinu, erytromycinu, ko-trimoxazolu, chloramfenikolu, tetracyclinu, klindamycinu, gentamicinu, amoxicilinu s klavulánovou kyselinou, teikoplaninu, vankomycinu, ciprofloxacinu a rifampicinu (stanoveno diskovou metodou [12]).

 

U šestnácti vybraných kmenů S. aureus izolovaných v letech 1998 v nemocnicích NJ a IVA byla na katedře genetiky a molekulární biologie na PřF MU v Brně provedena podrobná genotypizace [13]. Pro molekulární typizaci bakteriálních původců byla nejprve použita metoda analýzy makrorestrikčního spektra SmaI fragmentů genomové DNA, založená na využití pulzní elektroforézy (PFGE-subtypizace). Bylo zjištěno, že v letech 1998 dominovaly dva PFGE subtypy: typ ET1a v nemocnici NJ a typ ET2 v nemocnici IVA [12]. Zajímavé je, že DNA profil prevalentního PFGE typu ET2 je velmi podobný SmaI makrorestrikčnímu spektru epidemického typu ETA-produkujícího kmene S. aureus izolovaného v Kanadě v roce 1992 [14]. Při genotypizaci ET-pozitivních kmenů S. aureus izolovaných v letech 2001 byl opět identifikován dominující epidemický PFGE subtyp ET2, avšak v jiném regionu ČR, v nemocnici v Hradci Králové, zatímco subtyp ET1a se objevil v jediném případě, a to ve FNKV v Praze. Překvapivě, všichni původci puchýřnatého onemocnění novorozenců v Brně v roce 2002 byli zařazeni do PFGE subtypu ET4, který byl v minulých letech identifikován pouze jako minoritní subtyp, neboť se vyskytl pouze v jediném případě. V roce 2002 se opět vyskytl epidemický subtyp ET2 tentokrát v Pelhřimově. Ukázalo se, že ETA-pozitivní subtyp ET2, jehož podrobnou charakteristiku uvádíme v publikaci [13],  je stále přítomen v české populaci a lze jej tedy považovat za nejčastější potencionální zdroj dalších výskytů infekční stafylokokové epidermolýzy. Skutečnost, že genetické determinanty exfoliatinů se vyskytují na DNA mobilních elementech (eta gen na genomu mírného bakteriofága a etb gen na plazmidu), silně zvyšuje pravděpodobnost, že se brzy mohou objevit nové subtypy ET-produkujících kmenů S. aureus, které mohou rovněž vyvolat hromadné kožní infekce. 

 

Literatura

 

  [1]   Iandolo J J. Genetic analysis of extracelular toxins of Staphyloccocus aureus. Annu Rev Microbiol 1989; 43: 375-402.

  [2]   Ladhani S, Joannou CL, Lochrie DP, Evans RW, Poston SM. 1999. Clinical, microbial, and biochemical aspects of the exfoliative toxins causing staphylococcal scalded-skin syndrome. Clin Microbiol Rev 1999; 12: 224-242.

  [3]   Alouf JE,  and Alouf HM. 2003. Staphylococcal and streptococcal superantigens: molecular, biological and clinical aspects. Int J Med Microbiol 2003; 292: 429-440.

  [4]   Hacker JJ, Kaper B. Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annu Rev Microbiol 2000;  54: 641-679.

 [5]      Yoshizawa Y, Sakurada J, Sakurai S, Machida K, Kondo J, Masuda S. An exfoliative toxin A-converting phage isolated from Staphylococcus aureus strain ZM. Microbiol Immunol 2000; 44: 189-191.

 [6]    Jarraud S, Lyon GJ, Figueiredo AMS, Gerard L, Vandenesch F, Etienne J, Muir TW, Novick RP. 2000. Exfoliatin-producing strains define a fourth agr specifity group in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 2000;  22: 6517-6522.

 [7]    Yamaguchi T, Nishifuji K, Sakaki M, Fudaba Y, Aepfelbacher M, Takata T, Ohara M, Komatsuzawa H, Amagai M, Sugai M. 2002. Identification of the Staphylococcus aureus etd pathogenicity island which encodes a novel exfoliative toxin ETD and EDIN-B. Infect Immun 2002; 70: 5835-5845.

 [8]    Andersen LO. Differentiation and distribution of three types of exfoliative toxin produced by Staphylococcus hyicus from pigs  with exudative epidermitis. Imunol and Med Microbiol 1998;  20: 301-310.

 [9]      Rago JV, Vath GM, Tripp TJ, Bohach GA, Ohlendorf DH, Schlievert PM. Mutational analysis of superantigen staphylococcal exfoliative toxin A (ETA). J. Immun 2000; 164: 2207-2213.

[10]   Plano LRW, Gutman DM, Woischnik M, and Collins CM. Recombinant Staphyloccocus aureus exfoliative toxins are not superantigens. Infect Immun 2000; 5: 3048-3052.

[11]   Heyduková S. Závěrečná zpráva o hromadném výskytu kožního puchýřnatého onemocnění novorozenců v nemocnici Milosrdných bratří, Brno. Zprávy CEM (SZU, Praha) 2002; 11(4):164-168.         

[12] Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody.  Praha; Trios 1998.

[13]   Růžičková V, Pantůček R, Petráš P, Doškař J, Sedláček I, Rosypal S. Molecular typing of exfoliative toxin-producing staphylococcus aureus strains involved in epidermolytic infections. Int J Med Microbiol 2003;  292: 541-545.

[14]   Mackenzie A, Johnson W, Heyes B, Norrish B, Jamieson F. 1995. A prolonged outbreak of exfoliative toxin A-producing Staphylococcus aureus in a newborn nursery. Diagn Microbiol Infect Dis 1995; 21:  69-75.

 

 

 

RNDr. Vladislava Růžičková,CSc

Katedra genetiky a molekulární biologie, Přírodovědecká fakulta, MU, Brno

Email: vladkar@sci.muni.cz

 

RNDr. Petr Petráš,CSc.

Národní referenční laboratoř pro stafylokoky, SZU – CEM, Praha

Email: petrasi@szu.cz