Mikrobiologický průkaz kmenů MRSA, GISA A GRSA
Metodický list č. 18, 25. 2. 2003, NRL pro antibiotika, SZÚ
![]()
Pracovní skupina pro metody
vyšetřování antibiotické citlivosti (PSMVAC)*, Pracovní skupina pro monitorování
rezistence, NRL pro antibiotika, SZÚ Praha
* Členové PSMVAC: Urbášková P
(koordinátor), Bébrová E, Bergerová T, Henyšová J, Horníková M, Chmelařová E,
Kolář M, Melter O, Vaniš V.
Úvod
V průběhu druhé poloviny roku 2002 byly popsány případy infekcí způsobených kmeny MRSA, které byly současně vysoce rezistentní k vankomycinu. U těchto kmenů, nazývaných VRSA (vancomycin-resistant S. aureus) nebo přesněji GRSA (glykopeptide-resistant S. aureus), je rezistence ke glykopeptidům způsobena přítomností genu van A, získaného pravděpodobně konjugací od enterokoků [4].
Nebezpečí selhání léku volby oxacilinu při léčbě infekcí způsobených MRSA, častá multirezistence těchto kmenů a možnost výskytu kmenů MRSA se sníženou citlivostí či zcela rezistentních ke glykopeptidům zvýrazňuje význam rychlého získání spolehlivého výsledku vyšetření citlivosti. Laboratorní průkaz MRSA a GISA má určitá úskalí, neboť zejména heterorezistentní kmeny mohou uniknout pozornosti. Postup metod je proto nutno pečlivě dodržovat a kvalitu jejich provedení pravidelně kontrolovat.
Laboratorní průkaz
rezistence k antibiotikům u S. aureus
Zlatým standardem pro průkaz genu mecA je metoda PCR. S výsledky této metody poměrně dobře korespondují výsledky vyšetření přítomnosti produktu tohoto genu (enzymu PBP2a) metodou latexové aglutinace [5]. Výhodou obou zmíněných metod je rychlost získání výsledků v průběhu několika hodin.
K detekci rezistence k oxacilinu u homorezistentních a většiny heterorezistentních kmenů lze použít běžné fenotypové metody (disková difusní metoda, vyšetření MIC), které je však nutno upravit tak, aby vyhovovaly růstovým podmínkám MRSA. Při pečlivém dodržování předepsaných podmínek obvykle korespondují výsledky těchto metod s výsledky získanými metodou PCR. Fenotypové metody průkazu MRSA selhávají pokud populace S. aureus obsahuje extrémně nízký počet buněk rezistentních k oxacilinu (<=1 rezistentní buňka /100 000 000 buněk populace), protože tyto kmeny jsou obvykle inhibovány nižšími koncentracemi než 4 mg/l oxacilinu, kolem disku s 1 ug oxacilinu vytvářejí velké inhibiční zóny v nichž není patrný žádný růst, nerostou na vyhledávací půdě s 6 mg/l oxacilinu a tudíž se fenotypově jeví jako citlivé k oxacilinu. Pro vyhledávání MRSA v heterorezistentních populacích s extrémně nízkým počtem buněk rezistentních k oxacilinu se jako slibný jeví disk cefoxitinu [6], avšak doposud chybí naše vlastní zkušenosti s touto metodou. Vzhledem k tomu, že žádný fenotypový systém není zcela spolehlivý pro potvrzení MRSA, doporučuje se v rutinní laboratoři používat kombinaci více metod a výsledky ověřovat a podezřelé kmeny zasílat do speciální laboratoře ke konfirmaci genu mecA, případně i k epidemiologické analýze klonů MRSA vyskytujících se na daném území.
Metody pro průkaz intermediární rezistence nebo úplné rezistence ke glykopeptidům se týkají pouze kmenů MRSA. Heterorezistentní kmeny (hGISA) se obvykle vyznačují značným stupněm nestability glykopeptidové rezistence, a proto se při selhání léčby glykopeptidy u pacientů s infekcí MRSA doporučuje očkovat vzorky krve pacienta na běžné laboratorní půdy a případně také na půdu obsahující nízké koncentrace vankomycinu. Zatímco pro vysokou rezistenci lze pro průkaz GRSA použít běžné vyšetření MIC nebo vyhledávací metodu s 6 mg/l vankomycinu, průkaz GISA vyžaduje vysokou koncentraci inokula a jiné uspořádání vyhledávací metody [7].
Rutinní
vyšetření citlivosti poskytuje primárně informaci o antibiotikách, která jsou
pro rezistenci původce infekce nevhodná k léčbě. Kvantitativní údaje
vyšetření citlivosti k antibiotikům (minimální inhibiční koncentrace nebo
průměr zón inhibice) lze využít k fenotypové typizaci MRSA, neboť různé
epidemické kmeny se obvykle liší svými antibiogramy. Příslušnost kmene
k určitému klonu lze posoudit podle podobnosti kvantitativního
antibiogramu epidemiologicky definovaného souboru kmenů, podrobených
multivariabilní analýze. Výsledky antibiotické typizace korelují
s výsledky typizace klonů MRSA získanými elektroforézou fragmentů DNA
v pulsním poli (PFGE - pulsed field gel electrophoresis) a mohou sloužit
také k zjištění dynamiky šíření klonů [5].
a) Průkaz MRSA v klinickém materiálu
Rychlá identifikace MRSA ve vzorcích pacientů infikovaných nebo kolonizovaných MRSA může efektivně přispět k zahájení postupů omezujících šíření těchto bakterií v nemocnicích. Detekci urychlí naočkování vzorku pacienta na vyhledávací selektivně-diagnostickou půdu s oxacilinem a s vyšší koncentrací NaCl, která podporuje růst MRSA a inhibuje většinu druhů gramnegativních tyček. Tyto půdy mohou obsahovat také manitol a indikátor k předběžnému odlišení S. aureus od jiných stafylokoků, případně další antibiotikum k potlačení růstu jiných druhů bakterií (8). Vzorky je zapotřebí očkovat současně také na neselektivní krevní agar a na krevní agar se 4% NaCl, neboť zvýšená koncentrace soli podporuje růst MRSA. Postup a podmínky používání jedné z komerčních půd je v tabulce 1.
b) Detekce MRSA v čistých kulturách S. aureus
Rutinní metody vyšetřování citlivosti musí být upraveny tak, aby vyhovovaly růstovým podmínkám MRSA. Při vyšetřování fenotypu antibiotické rezistence se používá vyhledávací metoda pro MRSA v kombinaci s alespoň jednou běžně používanou metodou vyšetřování citlivosti (diskovou, diluční). NCCLS [2] doporučuje Mueller Hinton agar se 4% NaCl a se 6 mg/l oxacilinu (tabulka 2), na které lze spolehlivě vyhledat většinu MRSA s výjimkou heterorezistentních kmenů s extrémně nízkým počtem buněk rezistentních k oxacilinu. Naopak na slaném agaru se sníženým obsahem oxacilinu (2 mg/l) (tabulka 3) mohou vyrůstat kmeny které jsou pouhými hyperproducenty β-laktamázy. Efektivní se jeví použití obou vyhledávacích metod současně.
Podrobnosti provedení a podmínky zvyšující spolehlivost průkazu MRSA jsou uvedeny pro diskovou metodu s 1 ug oxacilinu v tabulce 4, s 30 ug cefoxitinu v tabulce 5, pro diluční mikrometodu v tabulce 6 a pro Etest v tabulce 7. Podezření na přítomnost MRSA lze ověřit metodou průkazu produktu PBP2a genu mecA (tabulka 8) nebo amplifikací genu mecA metodou PCR (tabulka 9). Podrobnosti přípravy a provádění fenotypových metod a vyšetření citlivosti S. aureus k jiným antibiotikům jsou uvedeny v podrobné příručce [9], zde jsou uvedeny metody pro průkaz MRSA doplněné o nové poznatky, které se v určitých podrobnostech od této příručky liší. Pro získání spolehlivého výsledku platí podmínka přesného dodržení postupu.
c) Detekce GISA, GRSA v čistých kulturách MRSA
Diskovou metodu nelze použít k vyšetření citlivosti S. aureus včetně MRSA ke glykopeptidům, a ani vyšetření MIC v běžném uspořádání dilučních metod není spolehlivé. Průkaz GISA vyžaduje vysokou koncentraci inokula a kvalitní živnou půdu. Kmeny GRSA lze zřejmě prokázat snadněji, doposud však chybí vlastní zkušenosti. K doporučovaným metodám patří vyhledávací metoda s 5 mg/l teikoplaninu (tabulka 10), vyhledávací metoda s 6 mg/l vankomycinu (tabulka 11) a Etest s vankomycinem a teikoplaninem, kde se používá inokulum o vysoké koncentraci buněk (tabulka 12). Spolehlivost průkazu zvyšuje použití více metod současně.
LITERATURA
3.
Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T,
Tenover FC. Methicillin-resistant Staphylococcus
aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J
Antimicrob Chemother 1997;40:135-136.
6.
Felten A, Grandry B, Lagrange PH, Casin I. Evaluation
of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA): disk diffusion method with cefoxitin and moxalactam, the
Vitek 2 System, and the MRSA-Screen Latex Agglutination Test. J Clin
Microbiol 2002;40:2766-2771.
9.
Urbášková
P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody.
Trios 1998.
Tabulka
1. Vyhledávání MRSA ze vzorků – skríningová metoda s 2 mg/l oxacilinu
(ORSAB Oxoid)
|
Půda |
Živný
agar s 5,5% NaCl a 2 mg/l oxacilinu. |
|
Očkování |
Vzorek
se masivně rozetře na vymezenou výseč vyhledávací půdy. |
|
Současně
se očkuje na krevní agar se 4% NaCl a
na obyčejný krevní agar. |
|
|
Inkubace |
24
hodin/35oC. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481). |
|
Pozitivní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271). |
|
Odečítání |
Hodnotí
se růst. |
|
Hodnocení |
Růst
dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA. |
|
Obsahuje-li
půda manitol a indikátor, půda kolem kolonií S. aureus (MRSA) se
zbarví. |
|
|
Další
vyšetření |
Izolace
kolonií z vyhledávací půdy na krevní agar a inkubace 24 hodin/35oC. |
|
Čistá
kultura se identifikuje rutinním způsobem (vyšetření produkce koagulázy). |
|
|
Další
postup, viz vyšetření citlivosti izolátů.
|
Tabulka
2. Vyhledávací metoda s 6 mg/l oxacilinu (2)
|
Půda |
MHA
agar se 4% NaCl a 6 mg/l oxacilinu. |
|
Inokulum |
Do
fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé
na krevním agaru. |
|
Dbá
se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie. |
|
|
Koncentrace inokula |
Upraví
se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu. |
|
Očkování |
10
ul inokula se rozetře kličkou na povrch agaru (průměr plochy 15 mm) a nechá
se zaschnout. |
|
Inkubace |
24
hodin/35oC. |
|
Negativní kontrola |
S.
aureus
ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481). |
|
Pozitivní kontrola |
S.
aureus
ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271). |
|
Odečítání |
Hodnotí
se růst. |
|
Hodnocení |
Růst
dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA. |
|
Další vyšetření |
Vyhledávací
metoda s 2 mg/l oxacilinu a další rutinní metoda vyšetření citlivosti. |
|
Ověření MRSA |
Latexová
aglutinace nebo PCR. |
Tabulka
3. Vyhledávací metoda s 2 mg/l oxacilinu*
|
Půda |
MHA
agar s 4-5,5% NaCl a 2 mg/l oxacilinu. |
|
Inokulum |
Do
fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé
na krevním agaru. |
|
Dbá
se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie. |
|
|
Koncentrace
inokula |
Upraví
se fyz. roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu. |
|
Očkování |
10
ul inokula se rozetře kličkou na povrch agaru (průměr plochy 15 mm) a nechá
se zaschnout. |
|
Inkubace |
24
hodin/35oC. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481). |
|
Pozitivní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271). |
|
Odečítání |
Hodnotí
se růst. |
|
Hodnocení |
Růst
dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA. |
|
Další
vyšetření |
Vyhledávací
metoda s 6 mg/l oxacilinu a další rutinní metoda vyšetření citlivosti. |
|
Ověření
MRSA |
Latexová
aglutinace nebo PCR. |
*
Lze použít komerční půdu, je však třeba striktně dodržet postup uvedený
v tabulce 3.
Tabulka
4. Disková metoda pro vyšetření citlivosti k oxacilinu (9)
|
Půda |
Mueller-Hinton
agar. |
|
Inokulum |
Do
fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé
na krevním agaru. |
|
Dbá
se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie. |
|
|
Koncentrace inokula |
Upraví
se fyz. roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu. |
|
Očkování |
Roztěr
na celou plochu agaru kličkou nebo přelitím a odsátím přebytku. |
|
Disk |
Disk
s 1 ug oxacilinu se umístí na povrch agaru. |
|
Celá
plocha disku musí být v kontaktu s agarem. |
|
|
Inkubace |
24
hodin/35oC. |
|
Negativní kontrola |
S.
aureus
ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481). |
|
Pozitivní kontrola |
S.
aureus ATCC
43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271). |
|
Odečítání |
Inhibiční
zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o. |
|
Pátrá
se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou. |
|
|
Průměr
zřetelné inhibiční zóny se změří obvyklým způsobem. |
|
|
Hodnocení |
Homorezistentní
populace MRSA obvykle nevytváří zóny inhibice. |
|
Heterorezistentní
populace vytváří zřetelné zóny inhibice s patrným růstem rezistentní
subpopulace MRSA v povlaku nebo jednotlivých koloniích. |
|
|
Heterorezistentní
populace s extrémně nízkým počtem rezistentních buněk vytváří zóny
inhibice jako citlivá populace (>=13 mm). |
|
|
Příčiny chyb |
Málo
koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky. |
|
Příliš
koncentrované inokulum může poskytnout falešně pozitivní výsledky. |
|
|
Další vyšetření |
Vyhledávací
metoda a diluční mikrometoda nebo Etest. |
|
Ověření MRSA |
Latexová
aglutinace nebo PCR. |
Tabulka
5. Disková metoda s cefoxitinem pro průkaz MRSA (6)
|
Půda |
Mueller-Hinton
agar. |
|
Inokulum |
Do
fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé
na krevním agaru. |
|
Dbá
se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie. |
|
|
Koncentrace inokula |
Upraví
se fyz. roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu. |
|
Očkování |
Roztěr
na celou plochu agaru kličkou nebo přelitím a odsátím přebytku. |
|
Disk |
Disk
s 30 ug cefoxitinu se umístí na povrch agaru. |
|
Celá
plocha disku musí být v kontaktu s agarem. |
|
|
Inkubace |
24
hodin/35oC. |
|
Negativní kontrola |
S.
aureus
ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481). |
|
Pozitivní kontrola |
S.
aureus ATCC
43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271). |
|
Odečítání |
Inhibiční
zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o. |
|
Pátrá
se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou. |
|
|
Průměr
zřetelné inhibiční zóny se změří obvyklým způsobem. |
|
|
Hodnocení |
MRSA
vytváří inhibiční zóny <27 mm. |
|
Příčiny chyb |
Málo
koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky. |
|
Příliš
koncentrované inokulum může poskytnout falešně pozitivní výsledky. |
|
|
Další vyšetření |
Vyhledávací
metoda a diluční mikrometoda nebo Etest. |
|
Ověření MRSA |
Latexová
aglutinace nebo PCR. |
|
Půda |
Mueller-Hinton
bujon (20-25 mg/l Ca2+ a 10-12,5 mg/l Mg2+) + 2 % NaCl
pro oxacilin. |
|
Koncentrace
oxacilinu |
Osm
ředění dvojnásobně geometrickou řadou (od 0,125 mg/l do 16 mg/l). |
|
Inokulum |
Do
fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé
na krevním agaru. |
|
Dbá
se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie. |
|
|
Koncentrace
inokula |
Upraví
se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu. |
|
Očkování |
1-5
ul podle typu jehlového inokulátoru. |
|
Inkubace |
24
hodin/35oC. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480). |
|
Pozitivní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC
6271). |
|
Odečítání |
MIC
je koncentrace v první jamce, která inhibuje růst. |
|
Hodnocení |
Homorezistentní
populace vykazuje zřetelný růst i ve vysokých konc. oxacilinu (>16 mg/l). |
|
Heterorezistentní
populace se může jevit jako citlivá k oxacilinu. |
|
|
Příčiny
chyb |
Málo
koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky. |
|
Příliš
koncentrované inokulum může poskytnout falešně pozitivní výsledky. |
|
|
Další
vyšetření |
Vyhledávací
metoda. |
|
Ověření
MRSA |
Latexová
aglutinace nebo PCR. |
|
Půda |
Mueller-Hinton
agar s 2% NaCl. |
|
Inokulum |
Do
fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé
na krevním agaru. |
|
Dbá
se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie. |
|
|
Koncentrace
inokula |
Upraví
se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu. |
|
Očkování |
Roztěr
0,2 ml inokula na celou plochu agaru kličkou. |
|
Etest |
Proužek
s oxacilinem se umístí na agar tak, aby jeho celá plocha byla
v kontaktu s agarem. |
|
Inkubace |
24
hodin/35oC. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480). |
|
Pozitivní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC
6271). |
|
Odečítání |
Inhibiční
zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o . |
|
Pátrá
se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou. |
|
|
Mikrokolonie
a izolované kolonie se zahrnují k rostoucí kultuře. |
|
|
MIC
se odečítá v místě úplné inhibice růstu kolonií, kde okraj inhibiční
zóny protíná proužek. |
|
|
Hodnocení |
Homorezistentní
populace vykazuje zřetelný růst i ve vysokých konc. oxacilinu (>16 mg/l). |
|
Heterorezistentní
populace se může jevit jako citlivá k oxacilinu. |
|
|
Příčiny
chyb |
Málo
koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky. |
|
Další
vyšetření |
Vyhledávací
metoda. |
|
Ověření
MRSA |
Latexová
aglutinace nebo PCR. |
|
Vyšetřovaný
kmen |
24
hodinová kultura na živném agaru. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481). |
|
Pozitivní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC
6271). |
|
Inokulum |
2
plné kličky o obsahu 1 ul (2 ul). |
|
Koncentrace
inokula |
1,5
x 109 buněk. |
|
Extrakce
PBP2a |
K
inokulu v mikrozkumavce se přidají 4 kapky činidla 1. |
|
Suspenze
se povaří po dobu 3 minut. |
|
|
Po
vyjmutí z lázně se mikrozkumavka nechá vychladnout pokojové teplotě. |
|
|
Přidá
se kapka činidla 2 a suspenze se promíchá. |
|
|
Suspenze
se centrifuguje při nízkých otáčkách (1500g) po dobu 15 min. |
|
|
Supernatant
se po centrifugaci odsaje. |
|
|
Latexová
aglutinace |
Na
podložku se přenese 50 ul supernatantu a promíchá se s 25
ul specifických Ig proti PBP2a značených latexem. |
|
Na
podložku se přenese 50 ul supernatantu a promíchá se 25 ul
nespecifických Ig proti PBP2a značenými latexem (negativní kontrola) |
|
|
Odečítání |
Suspenze
na podložce se promíchává obvyklým kolébavým způsobem. |
|
Odečítá
se nejdříve po 3 minutách a pak za 15 minut. |
|
|
Hodnocení |
Pozitivní:
zřetelná a typická aglutinace (vytvoření shluků v čiré tekutině). |
|
Negativní:
nezřetelná, nejasná aglutinace ve zkalené tekutině. |
|
|
Interpretace |
MRSA
– aglutinace jen se specifickými Ig
pro PBP2a. |
|
MRSA
negativní – žádná nebo netypická
aglutinace. |
|
|
Nemožno
interpretovat – aglutinace s negativní kontrolou. |
|
|
Příčiny
chyb |
Ingredience
nebyly před použitím řádně protřepány. |
|
Mikroorganizmus
není S. aureus. |
|
|
Suspenze
nebyla ve vodní lázni 3 minuty (prodloužení této doby snižuje senzitivitu,
zkrácení doby je příčinou nespecifické aglutinace). |
|
|
Supernatant
obsahoval sediment-buněčnou drť (nespecifická
aglutinace). |
|
|
Ověření
MRSA |
PCR. |
|
Vyšetřovaný
kmen |
24
hodinová kultura na živném agaru. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481). |
|
Pozitivní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 27626 (kontrola detekce mecA genu) |
|
Inokulum |
Do
mikrozkumavky s 0,5 ul lysostafinu (10 mg/ml) a 20 ul roztoku TE (10mM Tris,
1mM EDTA, pH8) se přidá inokulum 1 ul kličkou. |
|
Koncentrace
inokula |
1,5
x 109 buněk. |
|
Kontrola
amplifikace |
Primery
pro 16S rRNA (kontrola správně připravené templátové DNA) |
|
Lýza
buněk |
Inkubace
37oC/15 min. |
|
Denaturace |
95oC/15
min. |
|
Naředění
vzorku |
Přidá
se 180 ul deionizované vody, obsah se řádně protřepe na vortexu. |
|
Odstranění
drtě |
Centrifugace
13000 g/5 min. |
|
Templát |
2
ul supernatantu (do 50 ul PCR reakce) |
|
Primery |
RSM
2647: 5´-AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C-3´ |
|
RSM
2648: 5´-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTGC-3´ |
|
|
Parametry
PCR |
40
cyklů: 94oC/30 s, 55oC/30 s, 72oC/1 min. |
|
Závěrečná inkubace - 72oC/5 min. |
|
|
Detekce |
10
ul vzorku po amplifikaci, elfo; 2% agaróza, 1 hod. |
|
Odečítání |
Pozitivní
– amplikon (fragment DNA) velikosti 533 bp. |
|
Negativní
– žádný amplikon specifické velikosti. |
|
|
Příčiny
chyb |
Kontaminace
negativních vzorků prostřednictvím DNA pozitivních vzorků nebo pozitivní
kontroly (zdroj kontaminace-pipety, roztoky, neadekvátní prostorové podmínky
pro PCR). |
|
Nízká
senzitivita reakce - málo nebo příliš koncentrované inokulum (interference jiných
součástí buněk nebo ingrediencí použitých při přípravě templátu). |
|
|
Jiný
než popsaný způsob manipulace s ingrediencemi (falešná negativita). |
|
|
Malé
množství vzorku pro detekci (falešná negativita). |
|
Půda |
Mueller
Hinton agar s 5 mg/l teikoplaninu. |
|
Inokulum |
Klička
24 hodinové kultury MRSA z krevního agaru se očkuje do zkumavky s 5
ml BHI*. |
|
BHI
se inkubuje při 35oC přes noc. |
|
|
Koncentrace inokula |
10
ul kultury ve stacionární fázi růstu (neředěná kultura z BHI). |
|
Inokulace
|
Inokulum
se rozetře po povrchu půdy s teikoplaninem do plochy o průměru 15 mm. |
|
Inkubace |
48
hodin/35oC. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480). |
|
Pozitivní
kontrola |
E. faecalis ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530). |
|
Odečítání |
Odečítá
se růst. |
|
Hodnocení |
Růst
>=1 kolonie vede k podezření na GISA nebo GRSA. |
|
Příčiny
chyb |
Málo
koncentrované inokulum |
|
Další
vyšetření |
Etest
s vankomycinem a teikoplaninem a vysokou koncentrací inokula (tab.12). |
|
Ověření
GISA, GRSA |
Zaslat
do NRL/ATB. |
|
Půda |
Brain
Heart Infusion agar s 6 mg/l vankomycinu. |
|
Inokulum |
Klička
24 hodinové kultury MRSA z krevního agaru se očkuje do zkumavky s 5
ml BHI*. |
|
BHI
se inkubuje při 35oC přes noc. |
|
|
Koncentrace inokula |
10
ul kultury ve stacionární fázi růstu (neředěná kultura z BHI). |
|
Inokulace
|
Inokulum
se rozetře po povrchu půdy s vankomycinem do plochy o průměru 15 mm. |
|
Inkubace |
48
hodin/35oC. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus ATCC
29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480). |
|
Pozitivní
kontrola |
E.
faecalis
ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530). |
|
Odečítání |
Odečítá
se růst. |
|
Hodnocení |
Růst
>=1 kolonie vede k podezření na GISA nebo GRSA. |
|
Příčiny
chyb |
Málo
koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky. |
|
Další
vyšetření |
Etest
s vankomycinem a teikoplaninem a vysokou koncentrací inokula (tab.12). |
|
Ověření
GISA, GRSA |
Zaslat
do NRL/ATB. |
|
Půda |
Brain
Heart Infusion Agar. |
|
Inokulum |
Do
fyz. roztoku se rozetře několik kolonií z 24 hod. kultury MRSA vyrostlé
na krevním agaru. |
|
Koncentrace
inokula |
Upraví
se fyz. roztokem dle stupně 2 McFarlandova zákalového standardu. |
|
Očkování |
Roztěr
0,2 ml inokula na celou plochu agaru kličkou. |
|
Etest |
Proužek
s antibiotikem se umístí na agar tak, aby jeho celá plocha byla
v kontaktu s agarem. |
|
Inkubace |
48
hodin/ 35oC. |
|
Negativní
kontrola |
S.
aureus
ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480). |
|
Pozitivní
kontrola |
E. faecalis ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530) |
|
Odečítání |
Inhibiční
zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o . |
|
Pátrá
se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou. |
|
|
Mikrokolonie
a izolované kolonie se zahrnou do růstu. |
|
|
MIC
se odečítá v místě úplné inhibice růstu. |
|
|
Hodnocení |
Negativní:
MIC vankomycinu <8 mg/l, MIC teikoplaninu <12 mg/l. |
|
Pozitivní:
MIC vankomycinu a teikoplaninu >=8 mg/l, nebo MIC teikoplaninu >=12
mg/l*. |
|
|
Příčiny
chyb |
Málo
koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky. |
|
Ověření
GISA, GRSA |
Zaslat
do NRL/ATB. |
* bez ohledu na MIC vankomycinu.