Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2003; 12(4):164-171.

 

Mikrobiologický průkaz kmenů MRSA, GISA A GRSA

Metodický list č. 18, 25. 2. 2003, NRL pro antibiotika, SZÚ

Pracovní skupina pro metody vyšetřování antibiotické citlivosti (PSMVAC)*, Pracovní skupina pro monitorování rezistence, NRL pro antibiotika, SZÚ Praha

 

* Členové PSMVAC: Urbášková P (koordinátor), Bébrová E, Bergerová T, Henyšová J, Horníková M, Chmelařová E, Kolář M, Melter O, Vaniš V.

 

Úvod

MRSA, methicillin - resistant S. aureus, je tradiční název pro kmeny Staphylococcus aureus rezistentní k oxacilinu.  Rezistence MRSA k oxacilinu je způsobena produkcí alterované transpeptidázy nazvané penicillin - binding protein 2a (PBP2a), jejíž syntéza je kódována genem mecA. Podle počtu buněk s genem mecA se populace MRSA rozlišuje  jako homorezistentní (>=1 buňka s vysokým stupněm rezistence/100 buněk populace), populace s nižším počtem rezistentních buněk se označují jako heterorezistentní. Mechanismus heterorezistence není zcela objasněn, předpokládá se, že zahrnuje interakce mezi PBP2a a různými genovými produkty kódovanými geny fem (factor essential for methicillin resistance), které se účastní syntézy peptidoglykanu při stavbě buněčné stěny [1]. 

MRSA jsou typicky rezistentní ke všem beta-laktamovým antibiotikům, včetně jejich kombinací s inhibitory β-laktamáz a ke karbapenemům [2]. Samostatná rezistence k této skupině antibiotik se u MRSA vyskytuje výjimečně, mnohem častěji je sdružena s rezistencí k několika nebo většině antibiotik z dalších skupin, jako jsou makrolidy, aminoglykosidy, tetracyklin, rifampicin, fluorochinolony, chloramfenikol, méně často s rezistencí ke ko-trimoxazolu, mupirocinu, kyselině fusidové a doposud velmi vzácně ke glykopeptidům, linezolidu nebo kombinaci quinupristinu s dalfopristinem. Všechny izoláty MRSA, které byly necitlivé k vankomycinu, jevily až do zcela nedávné doby pouze intermediární stupeň rezistence k tomuto antibiotiku, respektive k dalšímu glykopeptidu, teikoplaninu. Označovaly se jako VISA (vancomycin–intermediate resistant S. aureus), nebo přesněji jako GISA (glycopeptide-intermediate-resistant S. aureus). U řady těchto izolátů není rezistence ke glykopeptidům homogenní a proto se označují se jako hGISA (heterorezistentní GISA). GISA vznikají z MRSA a doposud nepříliš dobře poznaným způsobem vytvářejí abnormálně silnou vrstvu peptidoglykanu, pravděpodobně jako reakci na přítomnost glykopeptidů v prostředí [3].

V průběhu druhé poloviny roku 2002 byly popsány případy infekcí způsobených kmeny MRSA, které byly současně vysoce rezistentní k vankomycinu. U těchto kmenů, nazývaných VRSA (vancomycin-resistant S. aureus) nebo přesněji GRSA (glykopeptide-resistant S. aureus), je rezistence ke glykopeptidům způsobena přítomností genu van A, získaného pravděpodobně konjugací od enterokoků [4].

Nebezpečí selhání léku volby oxacilinu při léčbě infekcí způsobených MRSA, častá multirezistence těchto kmenů a možnost výskytu kmenů MRSA se sníženou citlivostí či zcela rezistentních ke glykopeptidům zvýrazňuje význam rychlého získání spolehlivého výsledku vyšetření citlivosti. Laboratorní průkaz MRSA a GISA má určitá úskalí, neboť zejména heterorezistentní kmeny mohou uniknout pozornosti. Postup metod je proto nutno pečlivě dodržovat a kvalitu jejich provedení pravidelně kontrolovat. 

 

Laboratorní průkaz rezistence k antibiotikům u S. aureus

Zlatým standardem pro průkaz genu mecA je metoda PCR. S výsledky této metody poměrně dobře korespondují výsledky vyšetření přítomnosti produktu tohoto genu (enzymu PBP2a) metodou latexové aglutinace [5]. Výhodou obou zmíněných metod je rychlost získání výsledků v průběhu několika hodin.

K detekci rezistence k oxacilinu u homorezistentních  a většiny heterorezistentních  kmenů lze použít běžné fenotypové metody (disková difusní metoda, vyšetření MIC), které je však nutno upravit tak, aby vyhovovaly růstovým podmínkám MRSA. Při pečlivém dodržování předepsaných podmínek obvykle korespondují výsledky těchto metod s výsledky získanými metodou PCR.  Fenotypové metody průkazu MRSA selhávají pokud populace S. aureus obsahuje extrémně nízký počet buněk rezistentních k oxacilinu (<=1 rezistentní buňka /100 000 000 buněk populace), protože tyto kmeny jsou obvykle inhibovány nižšími koncentracemi než 4 mg/l oxacilinu, kolem disku s 1 ug oxacilinu vytvářejí velké inhibiční zóny v nichž není patrný žádný růst, nerostou na vyhledávací půdě s  6 mg/l oxacilinu a tudíž se fenotypově jeví jako citlivé k oxacilinu. Pro vyhledávání MRSA v heterorezistentních populacích s extrémně nízkým počtem buněk rezistentních k oxacilinu se jako slibný jeví disk cefoxitinu [6], avšak doposud chybí naše vlastní zkušenosti s touto metodou. Vzhledem k tomu, že žádný fenotypový systém není zcela spolehlivý pro potvrzení MRSA, doporučuje se v rutinní laboratoři používat kombinaci více metod a výsledky ověřovat a podezřelé kmeny zasílat do speciální laboratoře ke konfirmaci genu mecA, případně i k epidemiologické analýze klonů MRSA vyskytujících se na daném území.

Metody pro průkaz intermediární rezistence nebo úplné rezistence ke glykopeptidům se týkají pouze kmenů MRSA.  Heterorezistentní kmeny (hGISA) se obvykle vyznačují značným stupněm nestability glykopeptidové rezistence, a proto se při selhání léčby glykopeptidy u pacientů s infekcí MRSA doporučuje očkovat vzorky krve pacienta na běžné laboratorní půdy a případně také na půdu obsahující nízké koncentrace vankomycinu. Zatímco pro vysokou rezistenci lze pro průkaz GRSA použít běžné vyšetření MIC nebo vyhledávací metodu s 6 mg/l vankomycinu, průkaz GISA vyžaduje vysokou koncentraci inokula a jiné uspořádání vyhledávací metody [7].

Rutinní vyšetření citlivosti poskytuje primárně informaci o antibiotikách, která jsou pro rezistenci původce infekce nevhodná k léčbě. Kvantitativní údaje vyšetření citlivosti k antibiotikům (minimální inhibiční koncentrace nebo průměr zón inhibice) lze využít k fenotypové typizaci MRSA, neboť různé epidemické kmeny se obvykle liší svými antibiogramy. Příslušnost kmene k určitému klonu lze posoudit podle podobnosti kvantitativního antibiogramu epidemiologicky definovaného souboru kmenů, podrobených multivariabilní analýze. Výsledky antibiotické typizace korelují s výsledky typizace klonů MRSA získanými elektroforézou fragmentů DNA v pulsním poli (PFGE - pulsed field gel electrophoresis) a mohou sloužit také k zjištění dynamiky šíření klonů [5].

 

a) Průkaz MRSA v klinickém materiálu

Rychlá identifikace MRSA ve vzorcích pacientů infikovaných nebo kolonizovaných MRSA může efektivně přispět k zahájení postupů omezujících šíření těchto bakterií v nemocnicích. Detekci urychlí naočkování vzorku pacienta na vyhledávací selektivně-diagnostickou půdu s oxacilinem a s vyšší koncentrací NaCl, která podporuje růst MRSA a inhibuje většinu druhů gramnegativních tyček.  Tyto půdy mohou obsahovat také manitol a indikátor k předběžnému odlišení S. aureus od jiných stafylokoků, případně další antibiotikum k potlačení růstu jiných druhů bakterií (8). Vzorky je zapotřebí očkovat současně také na neselektivní krevní agar a na krevní agar se 4% NaCl, neboť zvýšená koncentrace soli podporuje růst MRSA. Postup a podmínky používání jedné z komerčních půd je v tabulce 1.

 

b) Detekce MRSA v čistých kulturách S. aureus

Rutinní metody vyšetřování citlivosti musí být upraveny tak, aby vyhovovaly růstovým podmínkám MRSA.  Při vyšetřování fenotypu antibiotické rezistence se používá vyhledávací metoda pro MRSA v kombinaci s alespoň jednou běžně používanou metodou vyšetřování citlivosti (diskovou, diluční). NCCLS [2] doporučuje Mueller Hinton agar se 4% NaCl a se 6 mg/l oxacilinu (tabulka 2), na které lze spolehlivě vyhledat většinu MRSA s výjimkou heterorezistentních kmenů s extrémně nízkým počtem buněk rezistentních k oxacilinu. Naopak na slaném agaru se sníženým obsahem oxacilinu (2 mg/l) (tabulka 3) mohou vyrůstat kmeny které jsou pouhými hyperproducenty β-laktamázy.  Efektivní se jeví použití obou vyhledávacích metod současně.

Podrobnosti provedení a podmínky zvyšující spolehlivost průkazu MRSA jsou uvedeny pro diskovou metodu s 1 ug oxacilinu v tabulce 4, s 30 ug cefoxitinu v tabulce 5, pro diluční mikrometodu v tabulce 6 a pro Etest v tabulce 7.  Podezření na přítomnost MRSA lze ověřit metodou průkazu produktu PBP2a  genu mecA (tabulka 8) nebo amplifikací genu mecA metodou PCR (tabulka 9). Podrobnosti přípravy a provádění fenotypových metod a vyšetření citlivosti S. aureus k jiným antibiotikům jsou uvedeny v podrobné příručce [9], zde jsou uvedeny metody pro průkaz MRSA doplněné o nové poznatky, které se v určitých podrobnostech od této příručky liší. Pro získání spolehlivého výsledku platí podmínka přesného dodržení postupu.

 

c) Detekce GISA, GRSA v čistých kulturách MRSA

            Diskovou metodu nelze použít k vyšetření citlivosti S. aureus včetně MRSA ke glykopeptidům, a ani vyšetření MIC v běžném uspořádání dilučních metod není spolehlivé. Průkaz GISA vyžaduje vysokou koncentraci inokula a kvalitní živnou půdu. Kmeny  GRSA lze zřejmě prokázat snadněji, doposud však chybí vlastní zkušenosti. K doporučovaným metodám patří vyhledávací metoda s 5 mg/l teikoplaninu (tabulka 10), vyhledávací metoda s 6 mg/l vankomycinu (tabulka 11) a Etest s vankomycinem a teikoplaninem, kde se používá inokulum o vysoké koncentraci buněk (tabulka 12). Spolehlivost průkazu zvyšuje použití více metod současně.

 

LITERATURA

  1. Chambers HF. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications.  Clin Microbiol Rev 1997;10:781-791.
  2.  National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.; twelfth informational supplement. NCCLS document M100-S12, Pa, USA 2002.

3.        Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother 1997;40:135-136.

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Staphylococcus aureus resistant to vancomycin-United States, 2002. Morbid Mortal Weekly Rep 2002;51:565-567.
  2. Tenover FC, Arbeit R, Archer G, et al. Comparison of traditional and molecular methods of typing isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1994;32:407-415.

6.        Felten A, Grandry B, Lagrange PH, Casin I. Evaluation of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): disk diffusion method with cefoxitin and moxalactam, the Vitek 2 System, and the MRSA-Screen Latex Agglutination Test. J Clin Microbiol 2002;40:2766-2771.

  1. Walsh TR, Bolmström A, Qwárnström A, Ho P, Wotton M, Howe RA, MacGowan AP, Diekema D. Evaluation of current methods for detection of staphylococci with reduced susceptibility to glycopeptides. J Clin Microbiol 2001;39:2439-2444.
  2. Simor AE, Goodfellow J, Louie L, Louie M. Evaluation of a new medium, Oxacillin Resistance Screen Agar Base, for the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from clinical specimens. č2001;39:3422.

9.        Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody. Trios 1998.

 

 

 

Tabulka 1. Vyhledávání MRSA ze vzorků – skríningová metoda s 2 mg/l oxacilinu (ORSAB Oxoid)

 

Půda

Živný agar s 5,5% NaCl a 2 mg/l oxacilinu.

Očkování

Vzorek se masivně rozetře na vymezenou výseč vyhledávací půdy.

Současně se očkuje na krevní agar se  4% NaCl a na obyčejný krevní agar. 

Inkubace

24 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).

Odečítání

Hodnotí se růst.

Hodnocení

Růst dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA.

Obsahuje-li půda manitol a indikátor, půda kolem kolonií S. aureus (MRSA) se zbarví.

Další vyšetření

Izolace kolonií z vyhledávací půdy na krevní agar a inkubace 24 hodin/35oC.

Čistá kultura se identifikuje rutinním způsobem (vyšetření produkce koagulázy).

Další postup, viz vyšetření citlivosti izolátů.  

 

Tabulka 2. Vyhledávací metoda s 6 mg/l oxacilinu (2)

 

Půda

MHA agar se 4% NaCl a 6 mg/l oxacilinu.

Inokulum

Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.

Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.

Koncentrace inokula

Upraví se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.

Očkování

10 ul inokula se rozetře kličkou na povrch agaru (průměr plochy 15 mm) a nechá se zaschnout.

Inkubace

24 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).

Odečítání

Hodnotí se růst.

Hodnocení

Růst dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA.

Další vyšetření

Vyhledávací metoda s 2 mg/l oxacilinu a další rutinní metoda vyšetření citlivosti.

Ověření MRSA

Latexová aglutinace nebo PCR.

 

Tabulka 3. Vyhledávací metoda s 2 mg/l oxacilinu*

 

Půda

MHA agar s 4-5,5% NaCl a 2 mg/l oxacilinu.

Inokulum

Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.

Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.

Koncentrace inokula

Upraví se fyz. roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.

Očkování

10 ul inokula se rozetře kličkou na povrch agaru (průměr plochy 15 mm) a nechá se zaschnout.

Inkubace

24 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).

Odečítání

Hodnotí se růst.

Hodnocení

Růst dvou a více kolonií vede k podezření na MRSA.

Další vyšetření

Vyhledávací metoda s 6 mg/l oxacilinu a další rutinní metoda vyšetření citlivosti.

Ověření MRSA

Latexová aglutinace nebo PCR.

* Lze použít komerční půdu, je však třeba striktně dodržet postup uvedený v tabulce 3.

 

 

Tabulka 4. Disková metoda pro vyšetření citlivosti k oxacilinu (9)

 

Půda

Mueller-Hinton agar.

Inokulum

Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.

Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.

Koncentrace inokula

Upraví se fyz. roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.

Očkování

Roztěr na celou plochu agaru kličkou nebo přelitím a odsátím přebytku.

Disk

Disk s 1 ug oxacilinu se umístí na povrch agaru.

Celá plocha disku musí být v kontaktu s agarem.

Inkubace

24 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).

Odečítání

Inhibiční zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o.

Pátrá se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou.

Průměr zřetelné inhibiční zóny se změří obvyklým způsobem.

Hodnocení

Homorezistentní populace MRSA obvykle nevytváří zóny inhibice.

Heterorezistentní populace vytváří zřetelné zóny inhibice s patrným růstem rezistentní subpopulace MRSA v povlaku nebo jednotlivých koloniích.

Heterorezistentní populace s extrémně nízkým počtem rezistentních buněk vytváří zóny inhibice jako citlivá populace (>=13 mm).

Příčiny chyb

Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.

Příliš koncentrované inokulum může poskytnout falešně pozitivní výsledky.

Další vyšetření

Vyhledávací metoda a diluční mikrometoda nebo Etest.

Ověření MRSA

Latexová aglutinace nebo PCR.

 

Tabulka 5. Disková metoda s cefoxitinem pro průkaz MRSA (6)

 

Půda

Mueller-Hinton agar.

Inokulum

Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.

Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.

Koncentrace inokula

Upraví se fyz. roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.

Očkování

Roztěr na celou plochu agaru kličkou nebo přelitím a odsátím přebytku.

Disk

Disk s 30 ug cefoxitinu se umístí na povrch agaru.

Celá plocha disku musí být v kontaktu s agarem.

Inkubace

24 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 43300 (nebo jeho kopie CNCTC 6271).

Odečítání

Inhibiční zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o.

Pátrá se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou.

Průměr zřetelné inhibiční zóny se změří obvyklým způsobem.

Hodnocení

MRSA vytváří inhibiční zóny <27 mm.

Příčiny chyb

Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.

Příliš koncentrované inokulum může poskytnout falešně pozitivní výsledky.

Další vyšetření

Vyhledávací metoda a diluční mikrometoda nebo Etest.

Ověření MRSA

Latexová aglutinace nebo PCR.

 

Tabulka 6. Diluční mikrometoda pro vyšetření citlivosti k oxacilinu (9)

 

Půda

Mueller-Hinton bujon (20-25 mg/l Ca2+ a 10-12,5 mg/l Mg2+) + 2 % NaCl pro oxacilin.

Koncentrace oxacilinu

Osm ředění dvojnásobně geometrickou řadou (od 0,125 mg/l do 16 mg/l).

Inokulum

Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.

Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.

Koncentrace inokula

Upraví se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.

Očkování

1-5 ul podle typu jehlového inokulátoru.

Inkubace

24 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 43300  (nebo jeho kopie CNCTC 6271).

Odečítání

MIC je koncentrace v první jamce, která inhibuje růst.

Hodnocení

Homorezistentní populace vykazuje zřetelný růst i ve vysokých konc.  oxacilinu (>16 mg/l).

Heterorezistentní populace se může jevit jako citlivá k oxacilinu.

Příčiny chyb

Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.

Příliš koncentrované inokulum může poskytnout falešně pozitivní výsledky.

Další vyšetření

Vyhledávací metoda.

Ověření MRSA

Latexová aglutinace nebo PCR.

 

Tabulka 7. Etest pro vyšetření citlivosti k oxacilinu (ABBiodisk Solna)

 

Půda

Mueller-Hinton agar s 2% NaCl.

Inokulum

Do fyz. roztoku se rozetře 3-5 kolonií přímo z 24 hodinové kultury vyrostlé na krevním agaru.

Dbá se na to, aby byly zastoupeny všechny morfologicky odlišné kolonie.

Koncentrace inokula

Upraví se fyziologickým roztokem dle stupně 0,5-1 McFarlandova zákalového standardu.

Očkování

Roztěr 0,2 ml inokula na celou plochu agaru kličkou.

Etest

Proužek s oxacilinem se umístí na agar tak, aby jeho celá plocha byla v kontaktu s agarem.

Inkubace

24 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 43300  (nebo jeho kopie CNCTC 6271).

Odečítání

Inhibiční zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o .

Pátrá se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou.

Mikrokolonie a izolované kolonie se zahrnují k rostoucí kultuře.

MIC se odečítá v místě úplné inhibice růstu kolonií, kde okraj inhibiční zóny protíná proužek.

Hodnocení

Homorezistentní populace vykazuje zřetelný růst i ve vysokých konc. oxacilinu (>16 mg/l).

Heterorezistentní populace se může jevit jako citlivá k oxacilinu.

Příčiny chyb

Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.

Další vyšetření

Vyhledávací metoda.

Ověření MRSA

Latexová aglutinace nebo PCR.

 

Tabulka 8. Průkaz PBP2a latexovou aglutinací (MRSA-SCREEN Denko Seiken)

               

Vyšetřovaný kmen

24 hodinová kultura na živném agaru.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 43300  (nebo jeho kopie CNCTC 6271).

Inokulum

2 plné kličky o obsahu 1 ul (2 ul).

Koncentrace inokula

1,5 x 109 buněk.

Extrakce PBP2a

K inokulu v mikrozkumavce se přidají 4 kapky činidla 1.

Suspenze se povaří po dobu  3 minut.

Po vyjmutí z lázně se mikrozkumavka nechá vychladnout pokojové teplotě.

Přidá se kapka činidla 2 a suspenze se promíchá.

Suspenze se centrifuguje při nízkých otáčkách (1500g) po dobu 15 min.

Supernatant se po centrifugaci odsaje.

Latexová aglutinace

Na podložku se přenese 50 ul supernatantu a promíchá se s 25 ul specifických Ig proti PBP2a značených latexem.

Na podložku se přenese 50 ul supernatantu a promíchá se 25 ul  nespecifických Ig proti PBP2a značenými latexem (negativní kontrola)

Odečítání

Suspenze na podložce se promíchává obvyklým kolébavým způsobem.

Odečítá se nejdříve po 3 minutách a pak za 15 minut.

Hodnocení

Pozitivní: zřetelná a typická aglutinace (vytvoření shluků v čiré tekutině).

Negativní: nezřetelná, nejasná aglutinace ve zkalené tekutině.

Interpretace

MRSA –  aglutinace jen se specifickými Ig pro PBP2a.

MRSA negativní –  žádná nebo netypická aglutinace.

Nemožno interpretovat – aglutinace s negativní kontrolou.

Příčiny chyb

Ingredience nebyly před použitím řádně protřepány.

Mikroorganizmus není S. aureus.

Suspenze nebyla ve vodní lázni 3 minuty (prodloužení této doby snižuje senzitivitu, zkrácení doby je příčinou nespecifické aglutinace).

Supernatant obsahoval sediment-buněčnou drť (nespecifická aglutinace).

Ověření MRSA

PCR.

 

Tabulka 9. Amplifikace mecA genu pomocí PCR

 

Vyšetřovaný kmen

24 hodinová kultura na živném agaru.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 25923 (nebo jeho kopie CNCTC 5481).

Pozitivní kontrola

S. aureus ATCC 27626 (kontrola detekce mecA genu)

Inokulum

Do mikrozkumavky s 0,5 ul lysostafinu (10 mg/ml) a 20 ul roztoku TE (10mM Tris, 1mM EDTA, pH8) se přidá inokulum 1 ul kličkou.

Koncentrace inokula

1,5 x 109 buněk.

Kontrola amplifikace

Primery pro 16S rRNA (kontrola správně připravené templátové DNA)

Lýza buněk

Inkubace 37oC/15 min.

Denaturace

95oC/15 min.

Naředění vzorku

Přidá se 180 ul deionizované vody, obsah se řádně protřepe na vortexu.

Odstranění drtě

Centrifugace 13000 g/5 min.

Templát

2 ul supernatantu (do 50 ul PCR reakce)

Primery

RSM 2647: 5´-AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C-3´

RSM 2648: 5´-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTGC-3´

Parametry PCR

40 cyklů: 94oC/30 s, 55oC/30 s, 72oC/1 min.

Závěrečná inkubace - 72oC/5 min.

Detekce

10 ul vzorku po amplifikaci, elfo; 2% agaróza, 1 hod.

Odečítání

Pozitivní – amplikon (fragment DNA) velikosti 533 bp.

Negativní – žádný amplikon specifické velikosti.

Příčiny chyb

Kontaminace negativních vzorků prostřednictvím DNA pozitivních vzorků nebo pozitivní kontroly (zdroj kontaminace-pipety, roztoky, neadekvátní prostorové podmínky pro PCR).

Nízká senzitivita reakce - málo nebo příliš koncentrované inokulum (interference jiných součástí buněk nebo ingrediencí použitých při přípravě templátu).

Jiný než popsaný způsob manipulace s ingrediencemi (falešná negativita).

Malé množství vzorku pro detekci (falešná negativita).

 

Tabulka 10. Vyhledávací metoda pro GISA a GRSA  s 5 mg/l teikoplaninu (7)

 

Půda

Mueller Hinton agar s 5 mg/l teikoplaninu.

Inokulum

Klička 24 hodinové kultury MRSA z krevního agaru se očkuje do zkumavky s 5 ml BHI*.

BHI se inkubuje při 35oC přes noc.

Koncentrace inokula

10 ul kultury ve stacionární fázi růstu (neředěná kultura z BHI).

Inokulace

Inokulum se rozetře po povrchu půdy s teikoplaninem do plochy o průměru 15 mm.

Inkubace

48 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).

Pozitivní kontrola

E.  faecalis ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530).

Odečítání

Odečítá se růst.

Hodnocení

Růst >=1 kolonie vede k podezření na GISA nebo GRSA.

Příčiny chyb

Málo koncentrované inokulum

Další vyšetření

Etest s vankomycinem a teikoplaninem a vysokou koncentrací inokula (tab.12).

Ověření GISA, GRSA

Zaslat do NRL/ATB.

* Brain Heart Infusion

 

Tabulka 11. Vyhledávací metoda pro GISA a GRSA s 6 mg/l vankomycinu (2)

 

Půda

Brain Heart Infusion agar s 6 mg/l vankomycinu.

Inokulum

Klička 24 hodinové kultury MRSA z krevního agaru se očkuje do zkumavky s 5 ml BHI*.

BHI se inkubuje při 35oC přes noc.

Koncentrace inokula

10 ul kultury ve stacionární fázi růstu (neředěná kultura z BHI).

Inokulace

Inokulum se rozetře po povrchu půdy s vankomycinem do plochy o průměru 15 mm.

Inkubace

48 hodin/35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).

Pozitivní kontrola

E. faecalis ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530).

Odečítání

Odečítá se růst.

Hodnocení

Růst >=1 kolonie vede k podezření na GISA nebo GRSA.

Příčiny chyb

Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.

Další vyšetření

Etest s vankomycinem a teikoplaninem a vysokou koncentrací inokula (tab.12).

Ověření GISA, GRSA

Zaslat do NRL/ATB.

* Brain Heart Infusion

 

Tabulka 12. Etest  s vankomycinem a teikoplaninem (AB Biodisk, Solna)

 

Půda

Brain Heart Infusion Agar.

Inokulum

Do fyz. roztoku se rozetře několik kolonií z 24 hod. kultury MRSA vyrostlé na krevním agaru.

Koncentrace inokula

Upraví se fyz. roztokem dle stupně 2 McFarlandova zákalového standardu.

Očkování

Roztěr 0,2 ml inokula na celou plochu agaru kličkou.

Etest

Proužek s antibiotikem  se umístí na agar tak, aby jeho celá plocha byla v kontaktu s agarem.

Inkubace

48 hodin/ 35oC.

Negativní kontrola

S. aureus ATCC 29213 (nebo jeho kopie CNCTC 5480).

Pozitivní kontrola

E.  faecalis ATCC 51299 (nebo jeho kopie CNCTC 5530)

Odečítání

Inhibiční zóny se prohlíží ve světle pod úhlem 45o .

 

Pátrá se po nárůstu ojedinělých kolonií nebo povlaku, nejlépe při zvětšení lupou.

Mikrokolonie a izolované kolonie se zahrnou do růstu.

MIC se odečítá v místě úplné inhibice růstu.

Hodnocení

Negativní: MIC vankomycinu <8 mg/l, MIC teikoplaninu <12 mg/l.

Pozitivní: MIC vankomycinu a teikoplaninu >=8 mg/l, nebo MIC teikoplaninu >=12 mg/l*.

Příčiny chyb

Málo koncentrované inokulum poskytuje falešně negativní výsledky.

Ověření GISA, GRSA

Zaslat do NRL/ATB.

* bez ohledu na MIC vankomycinu.