Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2005; 14(3):122-124.

 

Nemocniční kmeny MRSA s negativním clumping-faktorem

Clumping factor-negative hospital MRSA strains

 

Petr Petráš, Filip Prusík, Otakar Nyč, Ivana Machová

 

Souhrn · Summary

V příspěvku je upozorněno na výskyt nemocničních kmenů MRSA, u kterých selhává důležitá skríningová reakce - zjištění clumping-faktoru (vázané koagulázy), pomocí latexového testu 3. generace. I morfologicky kmeny připomínají spíše kogulázanegativní stafylokoky. Jedná se přitom o velice rezistentní kmeny, podílející se na infekčním procesu. Podle ostatních fenotypových vlastností, i podle genetického průkazu nuc genu byly tyto izolázy potvrzeny jako druh Staphylococcus aures.

Je doporučena jednoduchá a levná metoda průkazu hyaluronidázy (dekapsulační test), která se v laboratorní diagnostice kmenů S. aureus v NRL pro stafylokoky velice osvědčila.   

 

 The authors point out that clumping factor (bound coagulase) negative hospital MRSA strains fail to be detected by the third generation clumping-factor latex test. These MRSA strains, morphologically similar to coagulase-negative staphylococci, are highly resistant causative agents of hospital infections.  Based on other phenotypic characteristics and the nuc gene detection, the clumping-factor negative isolates were confirmed as Staphylococcus aures.

The hyaluronidase decapsulation test, which is easy and cheap to perform and proved effective in the NRL for staphylococci, is recommended for laboratory diagnosis of S. aureus strains.   

 

 

Úvod

 

Stafylokoky se dělí do dvou hlavních skupin: koagulázapozitivní: dominantní patogen rodu Staphylococcus aureus (taxonomicky přesně Staphylococcus aureus subsp. aureus),  Staph. intermedius a dalších 5 stafylokoků, které se vyskytují u zvířat) a koagulázanegativní: zbývajících 40 stafylokoků.

Referenční metodou, podle jejíž výsledků se dá správně zařadit kmen stafylokoka do  zmíněných dvou skupin, je zjištění produkce volné koagulázy. V českých laboratořích se obvykle používá diagnostický přípravek Itest Stafy-koaguláza. V podstatě se jedná o vhodně pufrovanou králičí plazmu. Správný postup: do aglutinační zkumavky se dá 0,5 ml roztoku plazmy, přidá se 0,1 ml osmnáctihodinové bujonové kultury a směs se promíchá. Inkubuje se 3 hodiny při 37 oC a do druhého dne při laboratorní teplotě. Výsledek se odečítá po 1, 3 a 24 hodinách. Při pozitivní reakci dojde ke ztuhnutí plazmy nebo vytvoření sraženiny (exoprodukt stafylokoků, enzym koaguláza, vyvolá polymeraci fibrinogenu na fibrin a dochází ke vzniku fibrinového lemu.)  Kmeny S. aureus a S. intermedius lze často odlišit již při pozorném odčítání: S. aureus má obvykle pozitivní reakci po jedné hodině, u kmenů S. intermedius dochází k pozitivní reakci opožděně, až po 3 hodinách.

 

Vzhledem k tomu, že v humánní klinické bakteriologii se koagulázapozitivní kmeny S. intermedius vyskytují velice zřídka, zužuje se toto dilema na základní hamletovskou otázku: je to S. aureus nebo není. Kmenům zlatého stafylokoka se pak věnuje podstatně větší pozornost, zvláště jedná-li se o kmeny oxacilinrezistentní (MRSA).      

 

V bakteriologických laboratořích se v současnosti obvykle používá zjišťování vázané koagulázy, tzv. shlukovacího-, neboli clumping-faktoru. Vázaná koaguláza není exoprodukt, ale povrchový antigen stafylokoků, další faktor virulence stafylokokových kmenů, jehož působení je v infekčním procesu prakticky shodné s volnou koagulázou: enzymatickým působením vzniká z fibrinogenu fibrin. Stejně jako v jiných oblastech, i v diagnostice stafylokoků našly velké uplatnění latexové testy. Vhodně jich lze použít právě při zjišťování clumping–faktoru. Poslední, třetí generace těchto testů detekuje - vedle shlukovacího faktoru -  protein A (další důležitý povrchový antigen u kmenů S.aureus) a specifické kapsulární antigeny u oxacilinrezistentních  kmenů S. aureus.   

 

Zjišťování clumping-faktoru latexy se ve většině našich mikrobiologických laboratoří stalo skríningovým testem při odlišování kmenů S. aureus a stafylokoků kogulázanegativních (KNS). Nahradilo velice nepřesný "sklíčkový způsob", i některé další reakce, které se dříve k  prokázání  kmenů S. aureus používaly. Týká se to též testu „dnázy“, tj. zjišťování produkce termolabilní nukleázy. Tento enzym produkuje, mimo kmenů S. aureus a S. intermedius, i řada kmenů různých druhů KNS.    

 

Dokonce v laboratorní hantýrce výrazem "stafylokok má koagulázu" dnes často bakteriologové vyjádřují pozitivitu na clumpig-faktor a nikoliv na volnou koagulázu. Není to přesné. Vedle koagulázapozitivních kmenů S. aureus a S. intermedius mohou mít tuto reakci pozitivní i některé KNS, především: S. lugdunensis a S. schleiferi subsp. schleiferi. Oba dva druhy patří mezi závažná agens nemocničních infekcí. (Ko)aglutinace je u těchto druhů obvykle jemnější než u koagulázapozitivních kmenů. Pozitivní clumpig-faktor mohou mít i kmeny S. vitulinus a S. sciuri subsp.rodentium, které se mohou vzácně vyskytnout v humánním klinickém materiálu. U posledně jmenovaného druhu je charakteristické, že pozitivní je reakce jak s testovacím  latexem, tak i s latexem kontrolním. (Mimochodem, na tuto "zradu" můžeme někdy narazit i u kmenů z bývalého rodu Micrococcus.) 

 

Lze ale konstatovat, že latexová diagnostika ke zjišťování clumping-faktoru se v NRL pro stafylokoky i v terénních laboratořích velice osvědčila. Jejich obrovskou výhodou je jednoduchost a rychlost provedení. K průkazu stačí jedna až dvě kolonie kmene z  primokultury a test poskytuje výsledek do několika sekund.   

 

Aktuální situace - výskyt kmenů MRSA s negativním clumping-faktorem

 

Od začátku nového roku bylo do NRL pro stafylokoky posláno z Ústavu lékařské mikrobiologie II. LF KU v  Praze - Motole několik kmenů stafylokoků, které měly morfologii KNS (bez pigmentu, bez hemolýzy) a reakci na clumping-faktor měly negativní. Protože se jednalo o kmeny podílející se na infekčním procesu, rezistentní k oxacilinu i dalším antibiotikům (CXT, ERY, CLI, GEN, AMC, TEI, CIP), byly již v Ústavu lékařské mikrobiologie biochemicky identifikovány. Při použití STAPHYtestu 16 vyšel výsledek S. aureus. Je zajímavé, že automat Vitek kmeny identifikovat neuměl.

 

Další skupina kmenů měla žlutavý pigment i náznak hemolýzy (v NRL potvrzena slabá produkce hemolyzinů alfa a delta). I tyto izoláty měly test na clumpig-faktor negativní, STAPHYtestem vyšla identifikace S. aureus, přístroj Vitek tyto kmeny opět neidentifikoval.

 

V NRL pro stafylokoky jsme kmeny podrobily důkladnému fenotypovému studiu. Naprostá většina reakcí odpovídala druhu S. aureus. Kmeny měly pozitivní test volné koagulázy (i když některé opožděně), termostabilní nukleázy a hyaluronidázy. Identifikace S. aureus vyšla i na biochemických kitech STAPHYtest 16 (Pliva-Lachema), API Staph, ID 32 Staph a RAPIDEC Staph (BioMerieux).   

 

Identifikaci jsme si potvrdili i molekulárně-biologicky zjištěním přítomnosti nuc genu pomocí reakce PCR.  Jednalo se tedy o kmeny MRSA, což nám prokázal i výsledek růstu na selektivní půdě MRSA Select (Bio-Rad), kde všechny popisované kmeny rostly v podobě tmavorůžových kolonií.

 

Jediným testem, který byl negativní, bylo právě zjištění clumping-faktoru. To bylo opakovaně negativní, ať jsme použili Pastorex Staph-plus (Bio-Rad) nebo Staphytect Plus (Oxoid). V několika případech byla slabá pozitivní reakce u starších, 48hodinových kultur.

 

Pro srovnání jsme použili i diagnostikum Staphylase Test (Oxoid), které využívá k detekci clumping-faktoru pasivní hemaglutinaci. I tyto výsledky byly - až na jeden případ se starší kulturou - negativní. 

 

Je možné, že kmeny se chovají podobně jako před zavedením třetí generace latexových testů na clumping-faktor, kdy původní kapsulární polysacharidové antigeny u kmenů MRSA nedovolily latexovým partikulím přístup k povrchu buněk a tedy reakci s povrchovými antigeny.

 

Chtěli bychom na tuto skutečnost upozornit terénní laboratoře, průkaz kmenů S. aureus patří k nejdůležitějším zjištěním, která mikrobiolog infektologům i ostatním kolegům sděluje.

 

Připomínáme klasický test ke zjištění volné koagulázy, který kmeny jasně identifikoval. Je pravda, že některé izoláty měly reakci opožděnou, jak je typická pro druh S. intermedius, který má obvykle reakci na clumping-faktor negativní. Tento stafylokok byl ale zjištěním dalších charakteristik vyloučen.

 

Chtěli bychom znovu upozornit na jednoduchý a levný test ke zjištění produkce hyaluronidázy (též se používá označení test dekapsulační). Průkaz hyaluronidázy navrhl v r. 1985 prof. Skalka místo průkazu plazmakoagulázy k odlišení klinicky nejvýznamnějšího druhu Staphylococcus aureus  od ostatních druhů stafylokoků,  především k odlišení tehdy jediného známého dalšího  koagulázapozitivního druhu, Staphylococcus intermedius [1]. Test jsme převzali od kolegů z Mikrobiologického ústavu FN u sv. Anny v Brně a společnou práci s popisem metodiky jsme otiskli v květnovém čísle loňského ročníku Zpráv CEM [2]. Od té doby jsme vyšetřili tímto způsobem přes 800 izolátů stafylokoků, z těch bylo asi 500 kmenů S. aureus. Ve všech případech vyšla reakce u kmenů S. aureus pozitivní, ani jeden z kmenů KNS i kmeny S.  intermedius hyaluronidázu neprodukovaly. Jediným kmenem "non-S.aureus" s pozitivní reakcí hyaluronidázy zůstává veterinární sbírkový kmen S.hyicus.

 

Všechny inkriminované kmeny MRSA z motolské nemocnice s negativním clumping-faktorem hyaluronidázu produkovaly.

 

 

Metodika průkazu hyaluronidázy

 

Pro průkaz hyaluronidázy se použije dekapsulační test se kmenem Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, jehož pouzdra obsahují kyselinu hyaluronovou [3]. K čáře masivně naočkovaného streptokoka, široké asi 1,5 cm, se kolmo očkuje čára testovaného stafylokoka. Test se hodnotí po 18hodinové kultivaci při 37 °C. Pokud stafylokok hyaluronidázu produkuje, vytvoří se v blízkosti jeho linie v mukózním nárůstu S. equi patrný půlkruh bez hlenovitého nárůstu svědčící o rozrušení pouzdra (dekapsulaci) (viz obr.1). Výsledek je nutné odečíst druhý den ráno, poloměr zóny s dekapsulovaným S. equi se s dobou inkubace natolik zvětšuje, že další den již nelze tento test hodnotit.  

 

Obrázek 1.

 

Průkaz produkce hyaluronidázy u kmenů S. aureus

 

pro zvětšení klikněte na obrázek

 

Test je velmi jednoduchý a levný. Zapotřebí jsou pouze klasické plotny s krevním agarem a kmen Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, který se v laboratoři udržuje přeočkováním ve vlhkém prostředí, aby neztratil svou mukózní morfologii.

 

Literatura

 

1.  Skalka B. Hyaluronidázový test v diagnostice stafylokoků, Veter. Med. 1985; 30: 373-377.

2.  Andrysík T, Machová I, Petráš P, Votava M, Woznicová V. Průkaz hyaluronidázy u kmenů rodu Staphylococcus. Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2004; 13(5): 210 –212.

3. Raus J, Love DN. Characterization of coagulase-positive Staphylococcus intermedius and Staphylococcus aureus isolated from veterinary clinical specimens. J. Clin. Microbiol., 1983; 18: 789-792.

 

 

 

 

 

 

 

RNDr. Petr Petráš,CSc., ing. Ivana Machová

NRL pro stafylokoky SZÚ – CEM, Praha

 

MUDr. Filip Prusík

MUDr. Otakar Nyč

Ústav lékařské mikrobiologie II. LFKU, Praha