Zprávy
CEM (SZÚ, Praha) 2005; 14(3):122-124.
Nemocniční kmeny
MRSA s negativním clumping-faktorem
Clumping factor-negative hospital MRSA strains
Petr Petráš, Filip Prusík,
Otakar Nyč, Ivana Machová
Souhrn · Summary
V příspěvku je
upozorněno na výskyt nemocničních kmenů MRSA, u
kterých selhává důležitá
skríningová reakce - zjištění clumping-faktoru
(vázané koagulázy), pomocí latexového testu
3. generace. I morfologicky kmeny připomínají
spíše kogulázanegativní stafylokoky. Jedná se
přitom o velice rezistentní kmeny, podílející
se na infekčním procesu. Podle ostatních fenotypových
vlastností, i podle genetického průkazu nuc genu byly tyto izolázy potvrzeny jako druh Staphylococcus aures.
Je doporučena jednoduchá a
levná metoda průkazu hyaluronidázy (dekapsulační
test), která se v laboratorní diagnostice kmenů S. aureus v NRL pro stafylokoky velice
osvědčila.
The authors point
out that clumping factor (bound coagulase) negative hospital MRSA strains fail
to be detected by the third generation clumping-factor latex test. These MRSA
strains, morphologically similar to coagulase-negative staphylococci, are
highly resistant causative agents of hospital infections. Based on other phenotypic
characteristics and the nuc gene
detection, the clumping-factor negative isolates were confirmed as Staphylococcus aures.
The
hyaluronidase decapsulation test, which is easy and cheap to perform and proved
effective in the NRL for staphylococci, is recommended for laboratory diagnosis
of S. aureus strains.
Úvod
Stafylokoky se dělí do dvou hlavních skupin: koagulázapozitivní: dominantní patogen rodu Staphylococcus aureus (taxonomicky přesně Staphylococcus aureus subsp. aureus), Staph. intermedius a dalších 5 stafylokoků, které se vyskytují u zvířat) a koagulázanegativní: zbývajících 40 stafylokoků.
Referenční metodou,
podle jejíž výsledků se dá správně
zařadit kmen stafylokoka do
zmíněných dvou skupin, je zjištění produkce volné koagulázy.
V českých laboratořích se obvykle
používá diagnostický přípravek Itest
Stafy-koaguláza. V podstatě se jedná o vhodně
pufrovanou králičí plazmu. Správný postup: do aglutinační zkumavky se dá
0,5 ml roztoku plazmy, přidá se 0,1 ml
osmnáctihodinové bujonové kultury a směs se
promíchá. Inkubuje se 3 hodiny při 37 oC a do
druhého dne při laboratorní teplotě. Výsledek se
odečítá po 1,
Vzhledem k tomu, že v humánní klinické bakteriologii se koagulázapozitivní kmeny S. intermedius vyskytují velice zřídka, zužuje se toto dilema na základní hamletovskou otázku: je to S. aureus nebo není. Kmenům zlatého stafylokoka se pak věnuje podstatně větší pozornost, zvláště jedná-li se o kmeny oxacilinrezistentní (MRSA).
V bakteriologických laboratořích se v současnosti obvykle používá zjišťování vázané koagulázy, tzv. shlukovacího-, neboli clumping-faktoru. Vázaná koaguláza není exoprodukt, ale povrchový antigen stafylokoků, další faktor virulence stafylokokových kmenů, jehož působení je v infekčním procesu prakticky shodné s volnou koagulázou: enzymatickým působením vzniká z fibrinogenu fibrin. Stejně jako v jiných oblastech, i v diagnostice stafylokoků našly velké uplatnění latexové testy. Vhodně jich lze použít právě při zjišťování clumping–faktoru. Poslední, třetí generace těchto testů detekuje - vedle shlukovacího faktoru - protein A (další důležitý povrchový antigen u kmenů S.aureus) a specifické kapsulární antigeny u oxacilinrezistentních kmenů S. aureus.
Zjišťování clumping-faktoru latexy se ve většině našich mikrobiologických laboratoří stalo skríningovým testem při odlišování kmenů S. aureus a stafylokoků kogulázanegativních (KNS). Nahradilo velice nepřesný "sklíčkový způsob", i některé další reakce, které se dříve k prokázání kmenů S. aureus používaly. Týká se to též testu „dnázy“, tj. zjišťování produkce termolabilní nukleázy. Tento enzym produkuje, mimo kmenů S. aureus a S. intermedius, i řada kmenů různých druhů KNS.
Dokonce v laboratorní
hantýrce výrazem "stafylokok má
koagulázu" dnes často bakteriologové
vyjádřují pozitivitu na clumpig-faktor a nikoliv na volnou
koagulázu. Není to přesné. Vedle
koagulázapozitivních kmenů S. aureus a S. intermedius
mohou mít tuto reakci pozitivní i některé KNS,
především:
S. lugdunensis a
S. schleiferi subsp. schleiferi.
Oba dva druhy patří mezi závažná agens
nemocničních infekcí. (Ko)aglutinace je u těchto
druhů obvykle jemnější než u
koagulázapozitivních kmenů. Pozitivní clumpig-faktor
mohou mít i kmeny S. vitulinus
a S. sciuri subsp.rodentium, které se mohou
vzácně vyskytnout v humánním klinickém
materiálu. U posledně
jmenovaného druhu je charakteristické, že pozitivní
je reakce jak s testovacím
latexem, tak i s latexem kontrolním. (Mimochodem, na tuto
"zradu" můžeme někdy narazit i u kmenů z
bývalého rodu Micrococcus.)
Lze ale konstatovat, že latexová diagnostika ke zjišťování clumping-faktoru se v NRL pro stafylokoky i v terénních laboratořích velice osvědčila. Jejich obrovskou výhodou je jednoduchost a rychlost provedení. K průkazu stačí jedna až dvě kolonie kmene z primokultury a test poskytuje výsledek do několika sekund.
Aktuální
situace - výskyt kmenů MRSA s negativním clumping-faktorem
Od začátku nového roku bylo do NRL pro stafylokoky posláno z Ústavu lékařské mikrobiologie II. LF KU v Praze - Motole několik kmenů stafylokoků, které měly morfologii KNS (bez pigmentu, bez hemolýzy) a reakci na clumping-faktor měly negativní. Protože se jednalo o kmeny podílející se na infekčním procesu, rezistentní k oxacilinu i dalším antibiotikům (CXT, ERY, CLI, GEN, AMC, TEI, CIP), byly již v Ústavu lékařské mikrobiologie biochemicky identifikovány. Při použití STAPHYtestu 16 vyšel výsledek S. aureus. Je zajímavé, že automat Vitek kmeny identifikovat neuměl.
Další skupina kmenů měla žlutavý pigment i náznak hemolýzy (v NRL potvrzena slabá produkce hemolyzinů alfa a delta). I tyto izoláty měly test na clumpig-faktor negativní, STAPHYtestem vyšla identifikace S. aureus, přístroj Vitek tyto kmeny opět neidentifikoval.
V NRL pro stafylokoky jsme kmeny podrobily důkladnému fenotypovému studiu. Naprostá většina reakcí odpovídala druhu S. aureus. Kmeny měly pozitivní test volné koagulázy (i když některé opožděně), termostabilní nukleázy a hyaluronidázy. Identifikace S. aureus vyšla i na biochemických kitech STAPHYtest 16 (Pliva-Lachema), API Staph, ID 32 Staph a RAPIDEC Staph (BioMerieux).
Identifikaci jsme si potvrdili i molekulárně-biologicky zjištěním přítomnosti nuc genu pomocí reakce PCR. Jednalo se tedy o kmeny MRSA, což nám prokázal i výsledek růstu na selektivní půdě MRSA Select (Bio-Rad), kde všechny popisované kmeny rostly v podobě tmavorůžových kolonií.
Jediným testem, který byl negativní, bylo právě zjištění clumping-faktoru. To bylo opakovaně negativní, ať jsme použili Pastorex Staph-plus (Bio-Rad) nebo Staphytect Plus (Oxoid). V několika případech byla slabá pozitivní reakce u starších, 48hodinových kultur.
Pro srovnání jsme použili i diagnostikum Staphylase Test (Oxoid), které využívá k detekci clumping-faktoru pasivní hemaglutinaci. I tyto výsledky byly - až na jeden případ se starší kulturou - negativní.
Je možné, že kmeny se chovají podobně jako před zavedením třetí generace latexových testů na clumping-faktor, kdy původní kapsulární polysacharidové antigeny u kmenů MRSA nedovolily latexovým partikulím přístup k povrchu buněk a tedy reakci s povrchovými antigeny.
Chtěli bychom na tuto skutečnost upozornit terénní laboratoře, průkaz kmenů S. aureus patří k nejdůležitějším zjištěním, která mikrobiolog infektologům i ostatním kolegům sděluje.
Připomínáme klasický test ke zjištění volné koagulázy, který kmeny jasně identifikoval. Je pravda, že některé izoláty měly reakci opožděnou, jak je typická pro druh S. intermedius, který má obvykle reakci na clumping-faktor negativní. Tento stafylokok byl ale zjištěním dalších charakteristik vyloučen.
Chtěli bychom znovu upozornit na jednoduchý a levný test ke zjištění produkce hyaluronidázy (též se používá označení test dekapsulační). Průkaz hyaluronidázy navrhl v r. 1985 prof. Skalka místo průkazu plazmakoagulázy k odlišení klinicky nejvýznamnějšího druhu Staphylococcus aureus od ostatních druhů stafylokoků, především k odlišení tehdy jediného známého dalšího koagulázapozitivního druhu, Staphylococcus intermedius [1]. Test jsme převzali od kolegů z Mikrobiologického ústavu FN u sv. Anny v Brně a společnou práci s popisem metodiky jsme otiskli v květnovém čísle loňského ročníku Zpráv CEM [2]. Od té doby jsme vyšetřili tímto způsobem přes 800 izolátů stafylokoků, z těch bylo asi 500 kmenů S. aureus. Ve všech případech vyšla reakce u kmenů S. aureus pozitivní, ani jeden z kmenů KNS i kmeny S. intermedius hyaluronidázu neprodukovaly. Jediným kmenem "non-S.aureus" s pozitivní reakcí hyaluronidázy zůstává veterinární sbírkový kmen S.hyicus.
Všechny inkriminované kmeny MRSA z motolské nemocnice s negativním clumping-faktorem hyaluronidázu produkovaly.
Metodika průkazu hyaluronidázy
Pro průkaz hyaluronidázy se použije
dekapsulační test se kmenem Streptococcus
equi subsp. zooepidemicus,
jehož pouzdra obsahují kyselinu hyaluronovou [3]. K čáře masivně
naočkovaného streptokoka,
široké asi
Obrázek 1.
Průkaz produkce
hyaluronidázy u kmenů S.
aureus
pro zvětšení klikněte na obrázek
Test je velmi jednoduchý a levný. Zapotřebí jsou pouze klasické plotny s krevním agarem a kmen Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, který se v laboratoři udržuje přeočkováním ve vlhkém prostředí, aby neztratil svou mukózní morfologii.
Literatura
1. Skalka B. Hyaluronidázový
test v diagnostice stafylokoků, Veter. Med. 1985; 30: 373-377.
2.
Andrysík T, Machová I, Petráš P, Votava M,
Woznicová V. Průkaz
hyaluronidázy u kmenů rodu
Staphylococcus. Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2004; 13(5): 210
–212.
3.
Raus J, Love DN. Characterization of coagulase-positive Staphylococcus intermedius and Staphylococcus
aureus isolated from veterinary clinical specimens. J. Clin. Microbiol.,
1983; 18: 789-792.
RNDr. Petr Petráš,CSc., ing. Ivana
Machová
NRL
pro stafylokoky SZÚ – CEM, Praha
MUDr. Filip
Prusík
MUDr.
Otakar Nyč
Ústav
lékařské mikrobiologie II. LFKU, Praha