Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2005; 14(5):243-246.
Zajímavý záchyt
korynebakterie, maskující se jako koagulázanegativní stafylokok
Detection of a peculiar Corynebacterium strain similar to coagulase-negative Staphylococcus
Petr Petráš, Gabriela Novotná, Ivana Machová,
Natalya Glavach –Hlaváčová, Eva Šimečková
Souhrn
· Summary
V příspěvku
upozorňujeme na zajímavý záchyt bakterie z klinického materiálu. Vzhled
jejích kolonií na krevním agaru velice připomíná koagulázanegativního
stafylokoka. Při biochemické identifikaci pomocí STAPHYtestu 16 vycházel málo
odlišený Staphylococcus capitis subsp.
capitis. Skríningové testy pro
stafylokoky (okyselování glycerolu, rezistence k furantoinu a bacitracinu)
a preparát dle Grama prozradily, že se jedná o zástupce rodu Corynebacterium. Kmen, který byl
izolován z popálené plochy kůže staršího pacienta, byl podle fenotypových i
genotypových vlastností určen jako Corynebacterium
striatum. Izolát byl nápadný též svou neobvyklou rezistencí.
Detection of a peculiar bacterial strain from clinical
material is reported. Its colonies on blood agar showed a highly similar
appearance to that of coagulase-negative staphylococci. Biochemical
identification using the STAPHYtest16 was suggestive of a Staphylococcus
capitis subsp. capitis. Screening tests for staphylococci (glycerol
acidification, resistance to furantoin and bacitracin) and the Gram
preparation differentiated a representative of the genus Corynebacterium. Based
on its phenotypic and genotypic characteristics, the strain isolated from the
burned skin of an elderly patient was identified as Corynebacterium striatum.
The isolate also showed unusual resistance.
Stručná kazuistika
Imunokompetentní pacient, 78letý muž, byl hospitalizován na chirurgickém oddělení ON Strakonice pro popáleninu 3. stupně na zádech, v sakrální a gluteální oblastech bilaterálně, jejíž plocha přesahovala 15 % tělesného povrchu. Týden před přijetím do nemocnice se opařil vodou z boileru. Lékařskou pomoc nevyhledal. Až po týdnu se telefonicky obrátil na praktického lékaře pro doporučení k chirurgickému ošetření. V nemocnici pak pobyl více jak 5 týdnů.
Průběh hospitalizace bez komplikaci. Pacientovi během hospitalizace byla provedena 2 x nekrektomie, při propuštění popálená plocha skoro zhojená až na zbývající nevelký defekt, který již zepitelizoval.
Bakteriologický nález
Kultivační nálezy z popálené plochy při přijetí pacienta k hospitalizaci (28.1.): Corynebacterium species (kmen nebyl blíže určen vzhledem k tomu, že byl považován za normální saprofytní kožní floru), Enterococcus faecalis, Staphylococcus intermedius ojedinělé a Candida albicans ojediněle.
Kontrolní kultivace z popálené plochy po 2 týdnech léčení (12.2.): Enterobacter cloacae hojně, Escherichia coli hojně, Staphylococcus haemolyticus a jeden kmen, který vypadal na krevním agaru jako další koagulázanegativní stafylokok (KNS).
Morfologicky se jednalo o drobné bílé kolonie bez hemolýzy,
produkující katalázu (viz obr.
1).
Obrázek
1: KOLONIE KMENE 05/175B Corynebacterium striatum
na
Columbia agaru (aerobně, 36 oC, 24 hod.)
Identifikace byla provedena pomocí STAPHYtestu 16 (PLIVA-Lachema), výsledek hodnocen podle kódové knihy jako nízké rozlišení mezi Staph. capitis susp. capitis (75,9 %) versus Staph. auricularis (19 %) či Micrococcus species (3,5 %). Kmen překvapil svou neobvyklou rezistencí. mj. byl totálně rezistentní k oxacilinu (inhibiční zóna 6 mm) a přitom dobře citlivý k cefoxitinu (inhibiční zóna 33 mm).
Kmen byl zaslán k bližšímu určení do NRL pro stafylokoky SZÚ-CEM. Byl označen číslem 05/175B.
Při identifikaci kmene KNS se nám v NRL osvědčily tři skríningové reakce, které pravidelně nasazujeme: okyselování glycerolu, rezistence k furantoinu (100 µg) a k bacitracinu (0,04 j.) [1]. Tato trojice dosti jednoznačně zařazuje kmeny do rodu Staphylococcus a vyčlení někdy morfologicky velice podobné kmeny mikrokoků a kmeny dalších rodů, které se od mikrokoků oddělily (Kocuria, Kytococcus, Dermacoccus). (Předpokládáme, event. si potvrdíme, že kmeny produkují katalázu. V preparátu by se mělo jednat o grampozitivní koky.)
Popisovaný kmen měl výsledky obrácené (tj. glycerol
neokyseloval, k furantoinu byl rezistentní a k bacitracinu citlivý),
čímž bylo zřejmé, že nepůjde o stafylokoka – viz tabulka
1.
Tabulka 1:
Výsledky kmene 05/175B při skríningových testech, používaných
v NRL/St pro zařazení do rodu Staphylococcus *) |
||||
|
|
|
|
|
Test |
"pravý stafylokok" |
výsledek kmene 05/175 B |
lim. zóna |
obsah látky v disku |
Produkce katalázy |
+ |
+ |
|
|
Okyselování glycerolu |
+ |
– |
|
|
Rezistence k
furantoinu |
citlivý |
rezistentní |
>= 9 mm |
100 ug |
Rezistence k
bacitracinu |
rezistentní |
citlivý |
>= 9 mm |
0,04 j. |
*)
samozřejmě se musí jednat o grampozitivní koky
Shodou okolností
jsme řešili v té době s Mgr. Gabrielou Novotnou z Mikrobiologického ústavu
Akademie věd ČR případ tří sbírkových kmenů, které byly původně identifikovány
jako S. capitis. V MBÚ AV
ČR se těmto kmenům věnovali z hlediska mechanismů rezistence
k makrolidovým a linkosamidovým antibiotikům. Kmeny byly
posléze geneticky potvrzeny jako Corynebacterium striatum.
Molekulárně biologická analýza byla provedena nejprve restrikční analýzou amplifikovaného úseku genu pro 16S
rRNA (PCR-RFLP). Produkt PCR reakce byl štěpen odděleně restrikčními enzymy AluI
a MnlI. Po elektroforetické separaci štěpených fragmentů v 2% agarózovém gelu byl výsledný
profil velikostí fragmentů porovnán s profily získanými in silico
ze sekvencí 16S rRNA druhu S. capitis a dalších stafylokoků uveřejněných
v RDP databázi (Ribosomal Database Project II) [10]. Protože shodný profil
tří kmenů, původně identifikovaných jako S. capitis neodpovídal tomuto
druhu, byl PCR produkt jednoho z nich sekvenován. Porovnáním sekvence
s databází byly tyto tři kmeny identifikovány jako Corynebacterium
striatum. Kmen 05/175 byl taktéž
podroben restrikční analýze a získaný profil odpovídal profilu pro Corynebacterium
striatum.
Biochemickými
reakcemi odpovídal kmen 05/175 B jak třem studovaným sbírkovým kmenům, tak
popisu uváděnému pro druh Corynebacterium striatum v literatuře [2]. Při použití
STAPHYtestu 16 vychází pouze tři pozitivní reakce: redukce nitrátů, sacharóza a
manóza. Ostatní jsou negativní, včetně VPtestu – viz tabulka 2.
Tabulka 2:
Výsledky biochemické identifikace kmene 05/175B na STAPHYtestu16
VPT |
URE |
ARG |
GAL |
GLR |
NIT |
PHS |
PYR |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
|
ESC |
SUC |
TRE |
MAN |
MLT |
MNS |
GLN *) |
|
– |
+ |
– |
– |
– |
+ |
– |
*) negativní reakce, tj. kmen je k novobiocinu
citlivý, je i diskovým způsobem
Vlastní identifikace
podle programu TNW vychází
1. Staphylococcus capitis subsp. capitis Identifikační skóre 68.61
T-index 0.684
2. Kocuria rosea Identifikační
skóre 25.45; T-index 0.569
s komentářem „kmen není odlišen“. Při uvedení výsledků rezistence
k furantoinu, citlivosti k bacitracinu a neschopnosti okyselovat
glycerol vyjde dvojice Kocuria varians
(IsSk 59.56) a Micrococcus lylae (Id Sk 25.46).
Pomocí kódové knihy
(kód: 001201) vychází „Nízké
rozlišení“ mezi Staph. capitis susp. capitis (75,9 %) versus Staph. auricularis (19 %) či Micrococcus
species (3,5 %), použije-li se jako doporučovaný dodatkový znak okyselování
glycerolu, vychází Micrococcus sp. (viz prvotní identifikace ve Strakonicích).
Provede-li se
identifikace podle dichotomické schématu pro orientační identifikaci KNS
z klinického materiálu ORIDES [9], vyjde
Staph. auricularis (kmen nemá
– na rozdíl od typového S. capitis subsp.
capitis) pozitivní manitol.
Velice zajímavá byla
rezistence kmene 05/175B k antibiotikům (disková metoda, půda MH, disky
Oxoid , literatura [3].
Kmen 05/175B byl
rezistentní k oxacilinu, erytromycinu, cotrimoxazolu, chloramfenikolu,
tetracyklinu a klindamycinu. Naopak ke druhé řadě antibiotik, které
v NRL/St používáme, byl citlivý:
gentamicin, amoxicilin/klavulánová kyselina, teikoplanin, vankomycin,
ciprofloxacin, rifampicin a cefoxitin. V podstatě shodnou rezistenci měly
i tři sbírkové kmeny, které byly v MÚ AV ČR určeny pomocí genetických
metod jako Corynebacterium striatum.
Korynebakterie
Hlavním patogenem rodu je samozřejmě původce záškrtu Corynebacterium
diphtheriae. Onemocnění stejného průběhu mohou způsobovat i kmeny Corynebacterium
ulcerans, pakliže jsou podobně jako difterické kmeny toxinogenní. Ostatní
koryneformní bakterie bývají součástí běžné mikroflóry na kůži. Mohou však
způsobovat infekce ran, případně katétrové sepse a onemocnění různých vnitřních
orgánů [4]. Jedná se obvykle o nozokomiální infekce. Obávaným nemocničním
patogenem je zvláště Corynebacterium jejkeium. Dalším bakteriálním
druhem, který byl v posledním době rozpoznán jako důležitý lidský patogen,
je Corynebacterium urealyticum [4].
Také Corynebacterium striatum je uváděno v literatuře jako podmíněný patogen, který může být příčinou
různých onemocnění u oslabených pacientů. Byly popsány respirační infekce,
které tato bakterie vyvolala [5, 6], endokarditida [7] ale též ranné infekce
(8).
Závěr
Upozorňujeme na tuto
zajímavou bakterii, která se v prvním přiblížení skutečně tváří jako
koagulázanegativní stafylokok (viz obr.1)
Vyjde-li pomocí STAPHYtestu16 nejasná identifikace „Staphylococcus capitis subsp. capitis,
je
vhodné zjistit schopnost okyselovat glycerol, zjistit citlivost kmene
k furantoinu a bacitracinu a udělat preparát Gramovým barvením.
Při negativním
okyselování glycerolu, rezistenci k furantoinu a citlivosti
k bacitracinu se bude jednat o Corynebacterium
striatum, což lze potvrdit v preparátu, kde budou koryneformní tyčinky - viz obr. 2. Na obrázku 3 je pro srovnání stejným způsobem připravený preparát kmene Staphylococcus haemolyticus.
Obrázek 2: FOTOGRAFIE Z MIKROSKOPU OLYMPUS
AX70
preparát
Corynebacterium
striatum (kmen 05/175B)
barveno dle Grama;
foto: RNDr. Aleš Balík, FGÚ AV ČR
Obrázek 3: FOTOGRAFIE Z MIKROSKOPU OLYMPUS
AX70
preparát
Staphylococcus
haemolyticus; barveno dle Grama;
foto: RNDr. Aleš Balík, FGÚ AV ČR
Poděkování
Děkujeme panu prof. MUDr. Miroslavu Votavovi,
CSc. za přečtení rukopisu i cenné rady.
Dále děkujeme panu RNDr. Aleši Balíkovi
z Fyziologického ústavu Akademie věd ČR
za zhotovení fotografií na mikroskopu Olympus AX70.
Literatura
1. Petráš P. Identifikace
stafylokoků z klinického materiálu.
Remedia – Klin Mikrobiol 1999; 3(2): 50–53.
2.
Martinez LM, Suaréz AI, Winstanley J, Ortega MC, Bernard K. J
Clin Microbiol 1995; 33(9): 2458–2461.
3. Urbášková P. Rezistence
bakterií k antibiotikům. Vybrané metody. ISBN 80-238-3106-2. TRIOS
Praha 1998.
4. Zahradníček O. Rod Corynebacterium str. 137–141; in: Votava
M a kol.(ed.) Lékařská mikrobiologie speciální. ISBN 80-902896-6-5. Neptun,
Brno 2003, s. 137–141.
5. Bowstead TT, Santiago, Jr. SM. Pleuropulmonary infection due to Corynebacterium striatum. Brit J Dis Chest 1980; 74: 198–200.
6. Cowling P, Hall L. Corynebacterium
striatum; a clinically significant isolate from sputum in chronic
obstructive airways diseases. J Infect 1993;
20: 335–336.
7. Markowitz SM, Coudron PE. Native valve endocarditis caused by an
organism resembling Corynebacterium
striatum. J Clin Microbiol 1990; 28: 8–10.
8. Funke G, Bernard KA. Corynephorm Gram-Positive Rods. str.
319–345; in: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenovet FC, Yolken RH (ed.)
Manual of Clinical Microbiology 7th edition
ASM Press, Washnghton, D.C. 1999, s. 319–345
9. Petráš P.
ORIDES - orientační identifikace koagulázanegativních stafylokoků z humánního klinického
materiálu. Epidemiol Mikrobiol Immunol.
1995; 44(1): 15–19.
10.
Cole JR, Chai B, Marsh TL, Farris RJ, Wang Q, Kulam SA, Chandra S, McGarrell
DM, Schmidt TM, Garrity GM, Tiedje JM. The Ribosomal Database Project (RDP-II):
previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new
prokaryotic taxonomy. Nucleic Acids Res
2003; 31: 442–443
Dr. Petr Petráš, ing.
Ivana Machová
NRL pro stafylokoky SZÚ–CEM
Mgr. Gabriela Novotná
Mikrobiologický ústav Akademie věd ČR
Dr. Natalya
Glavach–Hlaváčová
Pharm. Dr. Eva
Šimečková
Mikrobiologické oddělení NsP
Strakonice