Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2005; 14(5):240-243.

 

Uchovávání a transport kmenů Neisseria gonorrhoeae

Storage and transport of Neisseria gonorrhoeae strains

Barbora Macková

 

Souhrn · Sumary

Neisseria gonorrhoeae (gonokok) je bakterie velmi citlivá k vlivům vnějšího prostředí a mimo lidský organismus rychle hyne. Kultivace, transport a uchovávání kmenů gonokoků je díky jejich vlastnostem velice náročné. Příspěvek shrnující možnosti transportu a uchovávání kmenů gonokoků byl vytvořen na základě zkušeností NRL pro antibiotika a informací získaných z odborné literatury.

Neisseria gonorrhoeae (gonococcus) is a bacterium highly susceptible to the environment that dies rapidly outside the human body. Culture, transport and storage of gonococcal strains are very exacting due to their characteristics. Possibilities for transport and storage of gonococcal strains are summarized based on the literature and experience gained by the National Reference Laboratory for Antibiotics.  

 

 

Neisseria gonorrhoeae (gonokok) je nepohyblivý gramnegativní diplokok bez pouzdra s jemnými fimbriemi na povrchu. V lidském organismu se nachází především intracelulárně v polymorfonukleárních leukocytech. Je velmi citlivý na zevní prostředí a mimo lidský organismus rychle hyne. Přenáší se i přímým, ale častěji pohlavním kontaktem s nakaženou osobou. Působí akutní zánětlivé, plně vyléčitelné bakteriální onemocnění. Bez odpovídající terapie mohou vzniknout: chronický zánět pánve až neplodnost, postižení oka až slepota nebo celková infekce [4].

U obou pohlaví se gonokokové infekce vyskytují celosvětově, zejména ve skupině sexuálně aktivních adolescentů a mladých dospělých. Prevalence infekce je nejvyšší v komunitách s nižší socioekonomickou úrovní. V některých vyspělých zemích došlo během posledních 20 let k poklesu počtu gonokokových onemocnění. Znepokojujícím jevem je nejen celosvětové rozšíření, ale hlavně trvalý nárůst počtu rezistentních kmenů [2].

Mikrobiologická diagnóza je důležitá pro určení etiologie gonokokového onemocnění i pro stanovení citlivosti gonokoků k antibiotikům. Nejvýznamnějšími diagnostickými metodami jsou stále kultivace a mikroskopický průkaz gonokoků. V současnosti se k určení diagnózy používají i metody nekultivační (PCR, amplifikační metody). Některá vyšetření nelze z různých důvodů provádět na jednotlivých pracovištích ihned po odběru materiálu, proto je třeba kmeny uschovat nebo transportovat na jiné pracoviště, které dokončí mikrobiologická vyšetření nebo ověří již zjištěné výsledky. Kmeny gonokoků lze uchovávat krátkodobě nebo po delší dobu, dle potřeb příslušné laboratoře [5, 7].

      Základem správné laboratorní diagnózy je kvalitní odběr vzorku a jeho včasný transport do laboratoře. Přeprava vzorku od pacienta do laboratoře nebo mezi laboratořemi může ovlivnit záchyt hledaných patogenů. Gonokoky během transportu rychle hynou v důsledku vysychání nebo autolýzy buněk při nevhodné teplotě. Ve vzorku se za přítomnosti živin v tekutém prostředí mohou pomnožit méně náročné komenzální mikroorganismy, které patogena přerostou a zkreslí tak výsledek kultivace [6, 9, 10].

Větší výtěžnosti při kultivaci kmenů gonokoků lze dosáhnout naočkováním odebraného vzorku na kultivační půdu přímo u pacienta a zasláním takto naočkované půdy za příslušných kultivačních podmínek ihned do laboratoře. Tento postup se používá pokud je kultivační medium součástí odběrové soupravy. V současnosti existují komerčně vyráběné transportní systémy obsahující plotnu s kultivačním mediem a zajišťující vhodné prostředí pro kultivaci již během transportu [6, 9, 10].

Nelze-li očkovat vzorek na plotnu ihned po odběru, je vhodné použít pro dopravu vzorku do laboratoře nebo mezi dvěma laboratořemi transportní půdu. Transportní půdy udržují mikroorganismy během přepravy životaschopné a měly by je ve vzorku uchovat ve stejném počtu nebo alespoň ve stejném poměru v jakém se vyskytovaly v místě odběru. Pro udržení dostatečné vlhkosti jsou transportní půdy tekuté resp. polotuhé. Pro zabránění přerůstání méně náročných mikrobů neobsahují většinou žádné živiny. Metabolismus mikrobů v transportních půdách je omezen přídavkem redukujících činidel a přítomností agaru znesnadňujícího přístup vzdušného kyslíku. Aktivní uhlí v transportním mediu je optimální pro neutralizaci toxických iontů a vedlejších produktů bakteriálního metabolismu, ale může ovlivnit následné barvení mikroorganismů podle Grama [1, 6, 9, 10].

      Pro transport gonokoků je doporučeno používat Stuartovo nebo Amiesovo transportní medium.

      Stuartovo transportní médium bylo vyvinuto k zasílání urogenitálních stěrů při podezření na kapavku a trichomoniázu. Jedná se o polotuhé relativně redukované neživé médium umožňující přežití i náročných druhů bakterií. Současné modifikace obsahují thioglykolát sodný, někdy i cystein, dále chlorid vápenatý a glycerfosfát sodný, které slouží jako nárazník a zajišťují optimální osmotické poměry, methylenovou modř jako indikátor redox potenciálu a 0,3 % agaru. Původní formulace obsahovala i aktivní uhlí. Současné modifikace jsou bezbarvé a vyžadují použití detoxikovaných (černých) tamponů. Modré zbarvení smí být patrno jen při povrchu půdy. 90 % gonokoků v něm přežívá minimálně 24 hodin. Nevýhodou je možnost pomnožení některých gramnegativních, zejména koliformních, bakterií, které dovedou štěpit glycerfosfát a využít vzniklý glycerol jako zdroj energie [9]. Osvědčilo se použít transportní půdu v kombinaci s vatovým tamponem napuštěným bovinním albuminem, který neutralizuje inhibitory [10].

Amiesovo transportní médium je modifikací Stuartova média. Obsahuje thioglykolát, glycerfosfát je nahrazen anorganickým fosfátovým nárazníkem pro zamezení množení koliformních bakterií. Pro lepší přežívání gonokoků je k chloridu vápenatému přidán chlorid hořečnatý, chlorid draselný a 0,3 % NaCl. Oproti Stuartovu médiu neobsahuje methylenovou modř, je doplněno 1 % aktivního uhlí a koncentrace agaru je 0,4%. Existuje i v modifikaci bez aktivního uhlí, která vyžaduje použití detoxikovaných tamponů. Medium je vhodné používat v kombinaci s vatovým tamponem napuštěným bovinním albuminem [10].

      V České republice existuje různé firmy dodávajících transportní systémy. Podle studií i našich zkušeností představují transportní systémy firmy Copan (dodává Dispolab) rozumnou, snadno dostupnou a levnou alternativu pro transport gonokoků [8, 9]. Transportní systémy vyráběné různými firmami jsou dodávány ve všech nebo v některé z těchto čtyř variant: s nebo bez aktivního uhlí a s plastovou nebo s hliníkovou tyčinkou.

 

Pojmy a zkratky použité v textu

 

BHI

Brain Hearth Infusion – bujon z mozkosrdcové infuze, nutričně bohatý bujon

GC agar

Neselektivní půda pro kultivaci patogenních Neisseria (GC – gonoccocal)

kryotuba

Umělohmotná sterilní nádobka (lahvička) pro zmrazování

MHČ

Mueller Hinton čokoládový agar (neselektivní půda)

TN

Tekutý dusík ( -196 °C)

TSB

Trypticase Soy Broth - vysoce výživný univerzální bujon bez inhibitorů a indikátorů vhodný pro pomnožování běžných i náročných mikroorganismů

 

Krátkodobé uchování kmenů N. gonorrhoeae

 

      Využívá se pro uchování gonokoků před plánovaným provedením vyšetřovací metody nebo před transportem do jiné laboratoře (maximálně 2 týdny). Pokud zůstanou kmeny takto uchovány déle než 3 týdny, rychle ztrácejí životaschopnost. Doporučuje se neskladovat vzorky blízko dveří mrazícího boxu, protože by při jeho častém otevírání mohlo dojít k částečnému rozmražení uchovávaných kmenů. Rozmražený kmen nelze znovu zmrazit. Je-li třeba kmen znovu uložit, vytvoří se nová suspenze nebo se čerstvě narostlá kultura setře na nový suchý tampon [3, 5, 7].

 

1. Krátkodobé  uchování v TSB s přídavkem 15 % glycerolu při teplotě -20 °C.

 

Zamražení:

1)      do 1 ml TSB s přídavkem 15 % glycerolu se masivně naočkuje 24 hodinová čistá kultura kmene,

2)      suspenze se pomocí sterilní pasteurovy pipety přenese do kryotuby,

3)      kryotuba se označí a ihned vloží do -20 °C.

Vyočkování:

1)      obsah kryotuby se rozmrazí,

2)      suspenze kmene se naočkuje na GC agar nebo MHČ,

3)      inkubuje se 24–48 hodin ve 37 °C v 5 % CO2.

 

2. Krátkodobé uchování v -15 až -20 °C na suchém vatovém tamponu.

 

Zamražení:

1)      bohatě narostlá kultura se masivně setře na suchý vatový tampon,

2)      tampon se označí a uloží do mrazicího boxu (-15 až -20 °C).

 

Vyočkování:

1)      kmen se vyočkuje z tamponu na GC agar nebo MHČ,

2)      inkubuje se 24–48 hodin ve 37 °C v 5 % CO2.

 

Dlouhodobé uchování kmenů N. gonorrhoeae

 

Doporučenými metodami jsou uchování v TSB s přídavkem 15% glycerolu v  -70 °C nebo uchovávání v TN. Během procesu zmražování dochází k rozpadu většiny buněk. Opakované rozmrazování a zmrazování vzorků rychle snižuje životaschopnost mikroorganismů a může být příčinou úhynu kultury [5]. Pro opakované dlouhodobé uložení, dojde-li při vyočkovávání k úplnému rozmražení, je třeba vždy připravit novou suspenzi. Úplnému rozmražení během vyočkovávání lze zamezit krátkodobým přechováváním kryotub v ledové lázni.

Kmeny lze také lyofilizovat, ale tato metoda je pro většinu laboratoří velmi nákladná na peníze i na čas. Studie ukázaly, že kmeny gonokoků uchované ve formě lyofilizátu ztrácejí životaschopnost rychleji než kmeny dlouhodobě uchovávané ve zmraženém stavu.

 

1.      Dlouhodobé uchování v TSB s přídavkem 15 % glycerolu při teplotě -70 °C.

 

Zamražení:

1)      do 1 ml  TSB s přídavkem 15 % glycerolu se masivně naočkuje 24 hodinová čistá kultura kmene,

2)      suspenze se pomocí sterilní pasteurovy pipety přenese do kryotuby,

3)      kryotuba se označí a ihned vloží do -70°C.

 

Vyočkování:

1)      kousek zmrzlé půdy se sterilní (vypálenou) pinzetou nebo kličkou odlomí a umístí na GC agar nebo MHČ,

2)      po rozočkování se půda inkubuje 24–48 hodin ve 37 °C v 5 % CO2,

3)      kryotuba se ihned, dříve než obsah začne rozmrzat, vloží zpět do -70°C.

 

WHO doporučuje pro uchovávání kmenů gonokoků používat půdu s 15–20 % glycerolem. [5]

 

2. Dlouhodobé uchování v tekutém dusíku (TN) při -196 °C.

 

Zamražení:

1)      v 1,5 ml BHI  se z 24 hodinové čisté kultury kmene připraví silná suspenze,

2)      suspenze se pomocí sterilní pasteurovy pipety přenese do kryotuby,

3)      kryotuba se označí a uloží do TN.

Vyočkování:

1)      kmen se vyndá z TN a nechá se stát 5 minut při pokojové teplotě,

2)      sterilní (vypálenou) pinzetou nebo kličkou se odlomí kousek zmrzlé suspenze z kryotuby a umístí se na GC agar nebo MHČ,

3)      po rozočkování se půda inkubuje 24–48 hodin ve 37 °C v 5 % CO2,

4)      kryotuba se uzavře a neprodleně se vrátí do TN.

 

Transport kmenů N. gonorrhoeae [3, 6, 10]

 

1)      Typy tamponů vhodné pro transport gonokoků:

a)      tampon napuštěný sérovým albuminem (má minimální množství inhibitorů),

b)      kalcium alginátový tampon,

c)      tampony z vláken umělého hedvábí (mohou nahradit i transportní systémy).

Jiné typy tamponů (čistě bavlněný) mohou růst gonokoků inhibovat. Při výběru odběrových tamponů je třeba brát v úvahu i skutečnost, že černá barva tamponu může vzbudit negativní reakci pacienta.

2)      Pro odběr je vhodné použít dva tampony:

a)      ke zhotovení mikroskopického preparátu,

b)      ke kultivaci.

3)      Stuartovo nebo Amiesovo transportní medium. Vhodnější je Amiesovo transportní medium, ve kterém při pokojové teplotě přežijí 24 hodin téměř všechny kmeny gonokoků.

4)      Kmen lze ponechat v transportním mediu maximálně 48 hodin.

5)      Kmeny se transportují při pokojové teplotě (doporučuje se medium se vzorkem chladit).

6)      Ideální je vyočkování kmene z transportního media na medium růstové do 6 hodin po naočkování (do 12 hodin lze předpokládat 100 % přežití kultury, do 24 hodin přibližně 90 % přežití kultury, s přibývajícím časem životaschopnost mikroorganismu rychle klesá).

7)      Před transportem gonokoků mezi laboratořemi, pro následná vyšetření nebo jejich ověření, je vhodná kultivace kmene na vhodném růstovém mediu alespoň 12–24 hodin za příslušných podmínek. Teprve pak čerstvě narostlou kulturu gonokoků přeočkovat do transportního média.

       

Přehled půd používaných pro kultivaci N. gonorrhoeae

 

      Gonokoky se kultivují na selektivních nebo neselektivních půdách 24–48 hodin, v 37°C, v 5 % CO2. Základem všech selektivních půd je GC agar. Selektivní půdy obsahují suplementy, které mají zamezit růstu komenzálních bakterií a hub [9].

 

Neselektivní půdy

 

·        GC agar (gonococcal – pro gonokoky).

·        GC čokoládový agar.

·        Čokoládový agar (MHČ – Mueller Hinton čokoládový agar). 

 

Selektivní půdy

 

·        Thayer-Martin medium obsahuje suplement VCN (vankomycin 3 μg/ml, kolistin 7,5 μg/ml, nystatin 12,5 μg/ml), VCNT (+ trimethoprim 5μg/ml).

·        Martin-Lewisův agar je selektivnější (vankomycin 4 μg/ml, místo nystatinu obsahuje anisomycin potlačující kmeny Candida albicans, které inhibují růst gonokoků).

·        New York City (NYC) Medium - vankomycin 2 μg/ml, kolistin 7,5 μg/ml, amfotericin B a trimethoprim (suplement VCAT). Youngova modifikace obsahuje linkomycin 1 μg/ml místo vankomycinu (suplement LCAT).

 

Transgrow medium 

Selektivní medium pro transport a růst gonokoků současně (transport and growth). Připravuje se na jednotlivých pracovištích. Je variantou čokoládového agaru s přídavkem tří antibiotik. Tato media jsou sice výborná, ale jsou velice drahá.

 

Literatura:

 

1.       Arbique JC, Forward KR, LeBlanc J. Evaluation of four commercial transport media for the survival of Neisseria gonorrhoeae. Diagn Microbiol Infect Dis 2000; 36: 163-168.

2.       Bal C. Increasing antimicrobial resistance in STDs and the need for surveillance: Neisseria gonorrhoeae as a model. FEMS Immun Med Microbiol 1999; 24: 447-453.

3.       Harbec PS, Turcotte P. Preservation of Neisseria gonorrhoeae at -20°C. J Clin Microbiol 1996; 34: 1143-1146.

4.       Jephcott AE. Microbiological diagnosis of gonorrhoea. Genitourin Med 1997; 73: 245-252. 

5.       Knapp JS. Neisseria gonorrhoeae. In Perilla MJ, Ajello G, Bopp Ch, at al. Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Susceptibility of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. WHO. 2003: 63-102.

6.       Knapp JS, Koumans EH. Neisseria and Branhamella. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH, et al. Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition. ASM Press, 1999.

7.       Kuzemenská P a spol.. Laboratorní průkaz gramnegativních koků a kokobacilů. Avicenum – mikrobiologické vyšetřovací metody svazek č. 5. Praha 1987.

8.       Olsen CC, Schwebke JR, Benjamin WH Jr, Beverly A, Waites KB. Comparsion of direct inoculation and Copan transport systems for isolation of Neisseria gonorrhoeae from endocervical specimen. J Clin Microbiol 1999; 37: 3583-3585.

9.       Votava M, Kultivační půdy v lékařské mikrobiologii, Hortus, Brno 2000.

10.   WHO. Methods in the diagnosis of gonorrhoea. Regional Office for South-East Asia.

      http://w3.whosea.org/EN/Section10/Section17/Section53/Section479_1686.htm

 

 

 

MUDr. Barbora Macková

NRL pro antibiotika SZÚ - CEM