Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2005; 14(5):240-243.
Uchovávání
a transport kmenů Neisseria gonorrhoeae
Neisseria gonorrhoeae (gonokok) je bakterie velmi citlivá k vlivům vnějšího
prostředí a mimo lidský organismus rychle hyne. Kultivace, transport a
uchovávání kmenů gonokoků je díky jejich vlastnostem velice náročné. Příspěvek
shrnující možnosti transportu a uchovávání kmenů gonokoků byl vytvořen na
základě zkušeností NRL pro antibiotika a informací získaných z odborné
literatury.
Neisseria gonorrhoeae (gonococcus) is a bacterium
highly susceptible to the environment that dies rapidly outside the human body.
Culture, transport and storage of gonococcal strains are very exacting due to
their characteristics. Possibilities for transport and storage of gonococcal
strains are summarized based on the literature and experience gained by the
National Reference Laboratory for Antibiotics.
Neisseria
gonorrhoeae (gonokok) je nepohyblivý
gramnegativní diplokok bez pouzdra s jemnými fimbriemi na povrchu. V lidském
organismu se nachází především intracelulárně v polymorfonukleárních
leukocytech. Je velmi citlivý na zevní prostředí a mimo lidský organismus
rychle hyne. Přenáší se i přímým, ale častěji pohlavním kontaktem
s nakaženou osobou. Působí akutní zánětlivé, plně vyléčitelné bakteriální
onemocnění. Bez odpovídající terapie mohou vzniknout: chronický zánět pánve až
neplodnost, postižení oka až slepota nebo celková infekce [4].
U obou pohlaví se
gonokokové infekce vyskytují celosvětově, zejména ve skupině sexuálně aktivních
adolescentů a mladých dospělých. Prevalence infekce je nejvyšší v komunitách s
nižší socioekonomickou úrovní. V některých vyspělých zemích došlo během posledních
20 let k poklesu počtu gonokokových onemocnění. Znepokojujícím jevem je nejen celosvětové rozšíření, ale hlavně trvalý nárůst
počtu rezistentních kmenů [2].
Mikrobiologická diagnóza
je důležitá pro určení etiologie gonokokového onemocnění i pro stanovení
citlivosti gonokoků k antibiotikům. Nejvýznamnějšími diagnostickými metodami
jsou stále kultivace a mikroskopický průkaz gonokoků. V současnosti se
k určení diagnózy používají i metody nekultivační (PCR, amplifikační
metody). Některá vyšetření nelze z různých důvodů provádět na jednotlivých
pracovištích ihned po odběru materiálu, proto je třeba kmeny uschovat nebo
transportovat na jiné pracoviště, které dokončí mikrobiologická vyšetření nebo
ověří již zjištěné výsledky. Kmeny gonokoků lze uchovávat krátkodobě nebo po
delší dobu, dle potřeb příslušné laboratoře [5, 7].
Základem správné laboratorní diagnózy je
kvalitní odběr vzorku a jeho včasný transport do laboratoře. Přeprava vzorku od
pacienta do laboratoře nebo mezi laboratořemi může ovlivnit záchyt hledaných
patogenů. Gonokoky během transportu rychle hynou v důsledku vysychání nebo
autolýzy buněk při nevhodné teplotě. Ve vzorku se za přítomnosti živin
v tekutém prostředí mohou pomnožit méně náročné komenzální mikroorganismy,
které patogena přerostou a zkreslí tak výsledek kultivace [6, 9, 10].
Větší výtěžnosti při kultivaci kmenů gonokoků lze
dosáhnout naočkováním odebraného vzorku na kultivační půdu přímo u pacienta a
zasláním takto naočkované půdy za příslušných kultivačních podmínek ihned do
laboratoře. Tento postup se používá pokud je kultivační medium součástí
odběrové soupravy. V současnosti existují komerčně vyráběné transportní systémy
obsahující plotnu s kultivačním mediem a zajišťující vhodné prostředí pro
kultivaci již během transportu [6, 9, 10].
Nelze-li očkovat vzorek na plotnu ihned po odběru,
je vhodné použít pro dopravu vzorku do laboratoře nebo mezi dvěma laboratořemi transportní půdu. Transportní půdy
udržují mikroorganismy během přepravy životaschopné a měly by je ve vzorku
uchovat ve stejném počtu nebo alespoň ve stejném poměru v jakém se
vyskytovaly v místě odběru. Pro udržení dostatečné vlhkosti jsou
transportní půdy tekuté resp. polotuhé. Pro zabránění přerůstání méně náročných
mikrobů neobsahují většinou žádné živiny. Metabolismus mikrobů
v transportních půdách je omezen přídavkem redukujících činidel a
přítomností agaru znesnadňujícího přístup vzdušného kyslíku. Aktivní uhlí
v transportním mediu je optimální pro neutralizaci toxických iontů a
vedlejších produktů bakteriálního metabolismu, ale může ovlivnit následné
barvení mikroorganismů podle Grama [1, 6, 9, 10].
Pro
transport gonokoků je doporučeno používat Stuartovo nebo Amiesovo transportní
medium.
Stuartovo transportní médium bylo
vyvinuto k zasílání urogenitálních stěrů při podezření na kapavku a
trichomoniázu. Jedná se o polotuhé relativně redukované neživé médium
umožňující přežití i náročných druhů bakterií. Současné modifikace obsahují
thioglykolát sodný, někdy i cystein, dále chlorid vápenatý a glycerfosfát
sodný, které slouží jako nárazník a zajišťují optimální osmotické poměry,
methylenovou modř jako indikátor redox potenciálu a 0,3 % agaru. Původní
formulace obsahovala i aktivní uhlí. Současné modifikace jsou bezbarvé a
vyžadují použití detoxikovaných (černých) tamponů. Modré zbarvení smí být
patrno jen při povrchu půdy. 90 % gonokoků v něm přežívá minimálně 24
hodin. Nevýhodou je možnost pomnožení některých gramnegativních, zejména
koliformních, bakterií, které dovedou štěpit glycerfosfát a využít vzniklý
glycerol jako zdroj energie [9]. Osvědčilo se použít transportní půdu
v kombinaci s vatovým tamponem napuštěným bovinním albuminem, který
neutralizuje inhibitory [10].
Amiesovo transportní médium je modifikací Stuartova média. Obsahuje
thioglykolát, glycerfosfát je nahrazen anorganickým fosfátovým nárazníkem pro
zamezení množení koliformních bakterií. Pro lepší přežívání gonokoků je k
chloridu vápenatému přidán chlorid hořečnatý, chlorid draselný a 0,3 %
NaCl. Oproti Stuartovu médiu neobsahuje methylenovou modř, je doplněno 1 %
aktivního uhlí a koncentrace agaru je 0,4%. Existuje i v modifikaci bez
aktivního uhlí, která vyžaduje použití detoxikovaných tamponů. Medium je vhodné
používat v kombinaci s vatovým tamponem napuštěným bovinním albuminem
[10].
V České republice existuje
různé firmy dodávajících transportní systémy. Podle studií i našich zkušeností
představují transportní systémy firmy Copan (dodává Dispolab) rozumnou, snadno dostupnou
a levnou alternativu pro transport gonokoků [8, 9]. Transportní systémy
vyráběné různými firmami jsou dodávány ve všech nebo v některé z těchto
čtyř variant: s nebo bez aktivního uhlí a s plastovou nebo s
hliníkovou tyčinkou.
Pojmy a zkratky použité v textu
BHI |
Brain Hearth Infusion – bujon
z mozkosrdcové infuze, nutričně bohatý bujon |
GC agar |
Neselektivní půda pro kultivaci
patogenních Neisseria (GC – gonoccocal) |
kryotuba |
Umělohmotná sterilní nádobka
(lahvička) pro zmrazování |
MHČ |
Mueller Hinton čokoládový agar
(neselektivní půda) |
TN |
Tekutý dusík ( -196 °C) |
TSB |
Trypticase
Soy Broth - vysoce výživný univerzální bujon bez inhibitorů a indikátorů
vhodný pro pomnožování běžných i náročných mikroorganismů |
Krátkodobé uchování kmenů N. gonorrhoeae
Využívá se pro uchování gonokoků před plánovaným provedením vyšetřovací
metody nebo před transportem do jiné laboratoře (maximálně 2 týdny). Pokud
zůstanou kmeny takto uchovány déle než 3 týdny, rychle ztrácejí životaschopnost.
Doporučuje se neskladovat vzorky blízko dveří mrazícího boxu, protože by při
jeho častém otevírání mohlo dojít k částečnému rozmražení uchovávaných
kmenů. Rozmražený kmen nelze znovu zmrazit. Je-li třeba kmen znovu uložit,
vytvoří se nová suspenze nebo se čerstvě narostlá kultura setře na nový suchý
tampon [3, 5, 7].
1. Krátkodobé
uchování v TSB s přídavkem 15 % glycerolu při teplotě -20
°C.
Zamražení:
1)
do 1 ml TSB
s přídavkem 15 % glycerolu se masivně naočkuje 24 hodinová čistá kultura
kmene,
2)
suspenze se pomocí
sterilní pasteurovy pipety přenese do kryotuby,
3)
kryotuba se označí a
ihned vloží do -20 °C.
Vyočkování:
1)
obsah kryotuby se
rozmrazí,
2)
suspenze kmene se
naočkuje na GC agar nebo MHČ,
3)
inkubuje se 24–48
hodin ve 37 °C v 5 % CO2.
2. Krátkodobé uchování v -15 až -20 °C na suchém
vatovém tamponu.
Zamražení:
1)
bohatě narostlá
kultura se masivně setře na suchý vatový tampon,
2)
tampon se označí a
uloží do mrazicího boxu (-15 až -20 °C).
Vyočkování:
1)
kmen se vyočkuje
z tamponu na GC agar nebo MHČ,
2)
inkubuje se 24–48
hodin ve 37 °C v 5 % CO2.
Dlouhodobé uchování kmenů N. gonorrhoeae
Doporučenými metodami jsou uchování v TSB s
přídavkem 15% glycerolu v -70 °C nebo
uchovávání v TN. Během procesu zmražování dochází k rozpadu většiny buněk.
Opakované rozmrazování a zmrazování vzorků rychle snižuje životaschopnost
mikroorganismů a může být příčinou úhynu kultury [5]. Pro opakované dlouhodobé
uložení, dojde-li při vyočkovávání k úplnému rozmražení, je třeba vždy
připravit novou suspenzi. Úplnému rozmražení během vyočkovávání lze zamezit
krátkodobým přechováváním kryotub v ledové lázni.
Kmeny lze také lyofilizovat, ale tato metoda je
pro většinu laboratoří velmi nákladná na peníze i na čas. Studie ukázaly, že
kmeny gonokoků uchované ve formě lyofilizátu ztrácejí životaschopnost rychleji
než kmeny dlouhodobě uchovávané ve zmraženém stavu.
1. Dlouhodobé
uchování v TSB s přídavkem 15 % glycerolu při teplotě -70 °C.
Zamražení:
1)
do 1 ml TSB s přídavkem 15 % glycerolu se
masivně naočkuje 24 hodinová čistá kultura kmene,
2)
suspenze se pomocí
sterilní pasteurovy pipety přenese do kryotuby,
3)
kryotuba se označí a
ihned vloží do -70°C.
Vyočkování:
1)
kousek zmrzlé půdy
se sterilní (vypálenou) pinzetou nebo kličkou odlomí a umístí na GC agar nebo
MHČ,
2)
po rozočkování se
půda inkubuje 24–48 hodin ve 37 °C v 5 % CO2,
3)
kryotuba se ihned, dříve než obsah začne rozmrzat,
vloží zpět do -70°C.
WHO doporučuje pro uchovávání kmenů gonokoků
používat půdu s 15–20 % glycerolem. [5]
2. Dlouhodobé uchování
v tekutém dusíku (TN) při -196 °C.
Zamražení:
1)
v 1,5 ml BHI se z 24 hodinové čisté kultury kmene
připraví silná suspenze,
2)
suspenze se pomocí
sterilní pasteurovy pipety přenese do kryotuby,
3) kryotuba se označí a uloží do TN.
Vyočkování:
1)
kmen se vyndá
z TN a nechá se stát 5 minut při pokojové teplotě,
2)
sterilní (vypálenou)
pinzetou nebo kličkou se odlomí kousek zmrzlé suspenze z kryotuby a umístí
se na GC agar nebo MHČ,
3)
po rozočkování se
půda inkubuje 24–48 hodin ve 37 °C v 5 % CO2,
4)
kryotuba se uzavře a
neprodleně se vrátí do TN.
Transport kmenů N. gonorrhoeae [3, 6,
10]
1) Typy
tamponů vhodné pro transport
gonokoků:
a)
tampon napuštěný
sérovým albuminem (má minimální množství inhibitorů),
b)
kalcium alginátový
tampon,
c)
tampony
z vláken umělého hedvábí (mohou nahradit i transportní systémy).
Jiné typy tamponů (čistě bavlněný) mohou růst gonokoků inhibovat. Při výběru odběrových tamponů je třeba brát v úvahu i
skutečnost, že černá barva tamponu může vzbudit negativní reakci pacienta.
2) Pro odběr je vhodné použít dva tampony:
a)
ke zhotovení
mikroskopického preparátu,
b)
ke kultivaci.
3) Stuartovo
nebo Amiesovo transportní medium. Vhodnější je Amiesovo transportní medium, ve kterém při pokojové teplotě
přežijí 24 hodin téměř všechny kmeny gonokoků.
4) Kmen lze ponechat v transportním mediu maximálně
48 hodin.
5) Kmeny se transportují při pokojové teplotě
(doporučuje se medium se vzorkem chladit).
6) Ideální je vyočkování kmene z transportního media
na medium růstové do 6 hodin po naočkování (do 12 hodin lze předpokládat
100 % přežití kultury, do 24 hodin přibližně 90 % přežití kultury,
s přibývajícím časem životaschopnost mikroorganismu rychle klesá).
7) Před transportem gonokoků mezi laboratořemi, pro
následná vyšetření nebo jejich ověření, je vhodná kultivace kmene na vhodném
růstovém mediu alespoň 12–24 hodin za příslušných podmínek. Teprve pak čerstvě
narostlou kulturu gonokoků přeočkovat do transportního média.
Přehled půd používaných pro kultivaci N. gonorrhoeae
Gonokoky se kultivují na selektivních nebo neselektivních
půdách 24–48 hodin, v 37°C, v 5 % CO2. Základem všech
selektivních půd je GC agar. Selektivní půdy obsahují suplementy, které mají
zamezit růstu komenzálních bakterií a hub [9].
Neselektivní půdy
·
GC agar (gonococcal
– pro gonokoky).
·
GC čokoládový agar.
·
Čokoládový agar (MHČ
– Mueller Hinton čokoládový agar).
Selektivní půdy
·
Thayer-Martin medium obsahuje suplement VCN (vankomycin 3 μg/ml,
kolistin 7,5 μg/ml, nystatin 12,5 μg/ml), VCNT (+ trimethoprim
5μg/ml).
·
Martin-Lewisův agar je selektivnější (vankomycin 4 μg/ml, místo
nystatinu obsahuje anisomycin potlačující kmeny Candida albicans, které
inhibují růst gonokoků).
·
New York City (NYC) Medium - vankomycin 2 μg/ml, kolistin 7,5
μg/ml, amfotericin B a trimethoprim (suplement VCAT). Youngova modifikace
obsahuje linkomycin 1 μg/ml místo vankomycinu (suplement LCAT).
Transgrow medium
Selektivní medium pro transport a růst gonokoků současně
(transport and growth). Připravuje se na jednotlivých pracovištích. Je
variantou čokoládového agaru s přídavkem tří antibiotik. Tato media jsou
sice výborná, ale jsou velice drahá.
Literatura:
1. Arbique JC, Forward KR, LeBlanc J. Evaluation of four commercial transport
media for the survival of Neisseria
gonorrhoeae. Diagn Microbiol Infect
Dis 2000; 36:
163-168.
2. Bal C. Increasing
antimicrobial resistance in STDs and the need for surveillance: Neisseria gonorrhoeae as a model. FEMS Immun Med Microbiol 1999; 24: 447-453.
3. Harbec PS, Turcotte
P. Preservation of Neisseria gonorrhoeae
at -20°C. J Clin Microbiol 1996; 34: 1143-1146.
4. Jephcott AE. Microbiological diagnosis of gonorrhoea. Genitourin Med 1997; 73: 245-252.
5.
Knapp JS. Neisseria gonorrhoeae.
In Perilla MJ, Ajello G, Bopp Ch, at al. Manual for the Laboratory
Identification and Antimicrobial Susceptibility of Bacterial Pathogens of
Public Health Importance in the Developing World. WHO. 2003: 63-102.
6. Knapp JS, Koumans EH.
Neisseria and Branhamella. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH, et al. Manual of Clinical
Microbiology, 7th Edition.
ASM Press, 1999.
7.
Kuzemenská P a spol.. Laboratorní průkaz gramnegativních koků a kokobacilů.
Avicenum – mikrobiologické vyšetřovací metody svazek č. 5. Praha 1987.
8. Olsen CC, Schwebke JR, Benjamin WH Jr, Beverly A, Waites KB. Comparsion of
direct inoculation and Copan transport systems for isolation of Neisseria gonorrhoeae from endocervical
specimen. J Clin Microbiol 1999; 37: 3583-3585.
9.
Votava M, Kultivační půdy v lékařské mikrobiologii, Hortus, Brno 2000.
10. WHO. Methods in the
diagnosis of gonorrhoea. Regional Office for South-East Asia.
http://w3.whosea.org/EN/Section10/Section17/Section53/Section479_1686.htm
MUDr. Barbora Macková
NRL pro antibiotika SZÚ - CEM