Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2005; 14(5):243-246.

 

Zajímavý záchyt korynebakterie, maskující se jako koagulázanegativní stafylokok

Detection of a peculiar Corynebacterium strain similar to coagulase-negative Staphylococcus

 

Petr Petráš, Gabriela Novotná, Ivana Machová, Natalya Glavach –Hlaváčová, Eva Šimečková

 

Souhrn · Summary

V příspěvku upozorňujeme na zajímavý záchyt bakterie z klinického materiálu. Vzhled jejích kolonií na krevním agaru velice připomíná koagulázanegativního stafylokoka. Při biochemické identifikaci pomocí STAPHYtestu 16 vycházel málo odlišený Staphylococcus capitis subsp. capitis. Skríningové testy pro stafylokoky (okyselování glycerolu, rezistence k furantoinu a bacitracinu) a preparát dle Grama prozradily, že se jedná o zástupce rodu Corynebacterium. Kmen, který byl izolován z popálené plochy kůže staršího pacienta, byl podle fenotypových i genotypových vlastností určen jako Corynebacterium striatum. Izolát byl nápadný též svou neobvyklou rezistencí.

 

Detection of a peculiar bacterial strain from clinical material is reported. Its colonies on blood agar showed a highly similar appearance to that of coagulase-negative staphylococci. Biochemical identification using the STAPHYtest16 was suggestive of a Staphylococcus capitis subsp. capitis. Screening tests for staphylococci (glycerol acidification, resistance to furantoin and bacitracin) and the Gram preparation differentiated a representative of the genus Corynebacterium. Based on its phenotypic and genotypic characteristics, the strain isolated from the burned skin of an elderly patient was identified as Corynebacterium striatum. The isolate also showed unusual resistance.

 

 

Stručná kazuistika

 

Imunokompetentní pacient, 78letý muž, byl hospitalizován na chirurgickém oddělení ON Strakonice pro popáleninu 3. stupně na zádech, v sakrální a gluteální oblastech bilaterálně, jejíž plocha přesahovala 15 % tělesného povrchu. Týden před přijetím do nemocnice se opařil vodou z boileru. Lékařskou pomoc nevyhledal. Až po týdnu se telefonicky obrátil na praktického lékaře pro doporučení k chirurgickému ošetření. V nemocnici pak pobyl více jak 5 týdnů.

 

Průběh hospitalizace bez komplikaci. Pacientovi během hospitalizace byla provedena 2 x nekrektomie, při propuštění popálená plocha skoro zhojená až na zbývající  nevelký defekt, který již zepitelizoval.

 

Bakteriologický nález

 

Kultivační nálezy z popálené plochy při přijetí pacienta k hospitalizaci (28.1.): Corynebacterium species (kmen nebyl blíže určen vzhledem k tomu, že byl považován za normální saprofytní kožní floru), Enterococcus faecalis, Staphylococcus intermedius ojedinělé a Candida albicans ojediněle.

 

Kontrolní kultivace z popálené plochy po 2 týdnech léčení (12.2.): Enterobacter cloacae hojně, Escherichia coli hojně, Staphylococcus haemolyticus a jeden kmen, který vypadal na krevním agaru jako další koagulázanegativní stafylokok (KNS).

 

Morfologicky se jednalo o drobné bílé kolonie bez hemolýzy, produkující katalázu (viz obr.

1).

 

  Obrázek 1:  KOLONIE KMENE 05/175B Corynebacterium striatum

       na Columbia agaru (aerobně, 36 oC, 24 hod.)

 

 

Identifikace byla provedena pomocí STAPHYtestu 16 (PLIVA-Lachema), výsledek hodnocen podle kódové knihy jako nízké rozlišení mezi Staph. capitis susp. capitis (75,9 %) versus Staph. auricularis (19 %) či Micrococcus species (3,5 %). Kmen překvapil svou neobvyklou rezistencí. mj. byl totálně rezistentní k oxacilinu (inhibiční zóna 6 mm) a přitom dobře citlivý k cefoxitinu (inhibiční zóna 33 mm).

 

Kmen byl zaslán k bližšímu určení do NRL pro stafylokoky SZÚ-CEM.  Byl označen číslem 05/175B.

 

Při identifikaci kmene KNS se nám v NRL osvědčily tři skríningové reakce, které pravidelně nasazujeme: okyselování glycerolu, rezistence k furantoinu (100 µg) a k bacitracinu (0,04 j.) [1]. Tato trojice dosti jednoznačně zařazuje kmeny do rodu  Staphylococcus a vyčlení někdy morfologicky velice podobné kmeny mikrokoků a kmeny dalších rodů, které se od mikrokoků oddělily (Kocuria, Kytococcus, Dermacoccus). (Předpokládáme, event. si potvrdíme, že kmeny produkují katalázu. V preparátu by se mělo jednat o grampozitivní koky.) 

 

Popisovaný kmen měl výsledky obrácené (tj. glycerol neokyseloval, k furantoinu byl rezistentní a k bacitracinu citlivý), čímž bylo zřejmé, že nepůjde o stafylokoka – viz tabulka 1.

 

Tabulka 1:  Výsledky kmene 05/175B při skríningových testech, používaných v NRL/St  pro zařazení do rodu Staphylococcus  *)

 

 

 

 

 

Test

"pravý stafylokok"

výsledek kmene 05/175 B

lim. zóna

obsah látky v disku

Produkce katalázy

+

+

 

 

Okyselování glycerolu

+

 

 

Rezistence k furantoinu

citlivý   

rezistentní   

>= 9 mm  

100 ug

Rezistence k bacitracinu

rezistentní 

citlivý   

>= 9 mm

0,04 j.

*) samozřejmě se musí jednat o grampozitivní koky

 

 

Shodou okolností jsme řešili v té době s Mgr. Gabrielou Novotnou z Mikrobiologického ústavu Akademie věd ČR případ tří sbírkových kmenů, které byly původně identifikovány jako S. capitis. V MBÚ AV ČR se těmto kmenům věnovali z hlediska mechanismů rezistence k makrolidovým a linkosamidovým antibiotikům. Kmeny byly posléze geneticky potvrzeny jako Corynebacterium striatum.

 

Molekulárně biologická analýza byla provedena  nejprve restrikční analýzou amplifikovaného úseku genu pro 16S rRNA (PCR-RFLP). Produkt PCR reakce byl štěpen odděleně restrikčními enzymy AluI a MnlI. Po elektroforetické separaci štěpených fragmentů  v 2% agarózovém gelu byl výsledný profil velikostí fragmentů porovnán s profily získanými in silico ze sekvencí 16S rRNA druhu S. capitis a dalších stafylokoků uveřejněných v RDP databázi (Ribosomal Database Project II) [10]. Protože shodný profil tří kmenů, původně identifikovaných jako S. capitis neodpovídal tomuto druhu, byl PCR produkt jednoho z nich sekvenován. Porovnáním sekvence s databází byly tyto tři kmeny identifikovány jako Corynebacterium striatum.  Kmen 05/175 byl taktéž podroben restrikční analýze a získaný profil odpovídal profilu pro Corynebacterium striatum.

 

Biochemickými reakcemi odpovídal kmen 05/175 B jak třem studovaným sbírkovým kmenům, tak popisu uváděnému pro druh Corynebacterium striatum v literatuře [2]. Při použití STAPHYtestu 16 vychází pouze tři pozitivní reakce: redukce nitrátů, sacharóza a manóza. Ostatní jsou negativní, včetně VPtestu – viz tabulka 2.

 

Tabulka 2:  Výsledky biochemické identifikace kmene 05/175B na STAPHYtestu16

 

VPT

URE

ARG

GAL

GLR

NIT

PHS

PYR

+

 

ESC

SUC

TRE

MAN

MLT

MNS

GLN  *)

 

+

+

*)  negativní reakce, tj. kmen je k novobiocinu citlivý, je i diskovým způsobem

 

 

Vlastní identifikace podle programu TNW vychází

1. Staphylococcus capitis subsp. capitis    Identifikační skóre 68.61   T-index 0.684

2. Kocuria rosea                                         Identifikační skóre 25.45;  T-index 0.569

 

s komentářem  „kmen není odlišen“.  Při uvedení výsledků rezistence k furantoinu, citlivosti k bacitracinu a neschopnosti okyselovat glycerol vyjde dvojice Kocuria varians (IsSk 59.56) a Micrococcus lylae (Id Sk 25.46).

 

Pomocí kódové knihy (kód: 001201) vychází  „Nízké rozlišení“ mezi Staph. capitis susp. capitis (75,9 %) versus Staph. auricularis (19 %) či Micrococcus species (3,5 %), použije-li se jako doporučovaný dodatkový znak okyselování glycerolu, vychází  Micrococcus sp. (viz prvotní identifikace ve Strakonicích).          

 

Provede-li se identifikace podle dichotomické schématu pro orientační identifikaci KNS z klinického materiálu ORIDES [9], vyjde  Staph. auricularis (kmen nemá – na rozdíl od typového S. capitis subsp. capitis)  pozitivní manitol.              

             

Velice zajímavá byla rezistence kmene 05/175B k antibiotikům (disková metoda, půda MH, disky Oxoid , literatura [3].

Kmen 05/175B byl rezistentní k oxacilinu, erytromycinu, cotrimoxazolu, chloramfenikolu, tetracyklinu a klindamycinu. Naopak ke druhé řadě antibiotik, které v NRL/St používáme,  byl citlivý: gentamicin, amoxicilin/klavulánová kyselina, teikoplanin, vankomycin, ciprofloxacin, rifampicin a cefoxitin. V podstatě shodnou rezistenci měly i tři sbírkové kmeny, které byly v MÚ AV ČR určeny pomocí genetických metod jako Corynebacterium striatum.      

 

Korynebakterie

 

Hlavním patogenem rodu je samozřejmě původce záškrtu Corynebacterium diphtheriae. Onemocnění stejného průběhu mohou způsobovat i kmeny Corynebacterium ulcerans, pakliže jsou podobně jako difterické kmeny toxinogenní. Ostatní koryneformní bakterie bývají součástí běžné mikroflóry na kůži. Mohou však způsobovat infekce ran, případně katétrové sepse a onemocnění různých vnitřních orgánů [4]. Jedná se obvykle o nozokomiální infekce. Obávaným nemocničním patogenem je zvláště Corynebacterium jejkeium. Dalším bakteriálním druhem, který byl v posledním době rozpoznán jako důležitý lidský patogen, je Corynebacterium urealyticum [4].  

  

Také Corynebacterium striatum je uváděno v literatuře jako podmíněný patogen, který může být příčinou různých onemocnění u oslabených pacientů. Byly popsány respirační infekce, které tato bakterie vyvolala [5, 6], endokarditida [7] ale též ranné infekce (8).   

 

Závěr

 

Upozorňujeme na tuto zajímavou bakterii, která se v prvním přiblížení skutečně tváří jako koagulázanegativní stafylokok (viz obr.1) Vyjde-li pomocí STAPHYtestu16 nejasná identifikace „Staphylococcus capitis subsp. capitis,  je vhodné zjistit schopnost okyselovat glycerol, zjistit citlivost kmene k furantoinu a bacitracinu a udělat preparát Gramovým barvením.

Při negativním okyselování glycerolu, rezistenci k furantoinu a citlivosti k bacitracinu se bude jednat o Corynebacterium striatum, což lze potvrdit v preparátu, kde budou  koryneformní tyčinky - viz obr. 2. Na obrázku 3  je pro srovnání stejným způsobem připravený preparát kmene Staphylococcus haemolyticus.

 

Obrázek 2: FOTOGRAFIE Z MIKROSKOPU OLYMPUS AX70 

                 preparát Corynebacterium striatum (kmen 05/175B)

                 barveno dle Grama;

                 foto: RNDr. Aleš Balík, FGÚ AV ČR

 

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

 

Obrázek 3: FOTOGRAFIE Z MIKROSKOPU OLYMPUS AX70 

                 preparát Staphylococcus haemolyticus; barveno dle Grama;

                 foto: RNDr. Aleš Balík, FGÚ AV ČR

OLYMPUS DIGITAL CAMERA

 

 

 

 

 

Poděkování

Děkujeme panu prof. MUDr. Miroslavu Votavovi, CSc. za přečtení rukopisu i cenné rady. 

Dále děkujeme panu RNDr. Aleši Balíkovi z Fyziologického ústavu Akademie věd ČR  za zhotovení fotografií na mikroskopu Olympus AX70. 

 

 

Literatura

 

1. Petráš P. Identifikace stafylokoků z klinického materiálu. Remedia – Klin Mikrobiol 1999; 3(2): 50–53.

 

2. Martinez LM, Suaréz AI, Winstanley J, Ortega MC, Bernard K.  J Clin  Microbiol  1995; 33(9): 2458–2461.  

 

3. Urbášková P. Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody. ISBN 80-238-3106-2. TRIOS Praha 1998.

 

4. Zahradníček O. Rod Corynebacterium str. 137–141; in: Votava M a kol.(ed.) Lékařská mikrobiologie speciální. ISBN 80-902896-6-5. Neptun, Brno 2003, s. 137–141.

 

5.  Bowstead TT, Santiago, Jr. SM. Pleuropulmonary infection due to Corynebacterium striatum. Brit J Dis Chest 1980; 74: 198–200.   

 

6.  Cowling P, Hall L. Corynebacterium striatum; a clinically significant isolate from sputum in chronic obstructive airways diseases. J Infect 1993; 20: 335–336.

 

7.  Markowitz SM, Coudron PE. Native valve endocarditis caused by an organism resembling Corynebacterium striatum. J Clin Microbiol 1990; 28: 8–10.

 

8.  Funke G, Bernard KA. Corynephorm Gram-Positive Rods. str. 319–345; in: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenovet FC, Yolken RH (ed.) Manual of Clinical Microbiology 7th edition  ASM Press, Washnghton, D.C. 1999, s. 319–345

 

9.  Petráš P.  ORIDES - orientační identifikace koagulázanegativních  stafylokoků z humánního klinického materiálu. Epidemiol Mikrobiol Immunol. 1995; 44(1): 15–19.

 

10. Cole JR, Chai B, Marsh TL, Farris RJ, Wang Q, Kulam SA, Chandra S, McGarrell DM, Schmidt TM, Garrity GM, Tiedje JM. The Ribosomal Database Project (RDP-II): previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new prokaryotic taxonomy. Nucleic Acids Res 2003; 31: 442–443

 

 

Dr. Petr Petráš, ing. Ivana Machová

NRL pro stafylokoky SZÚ–CEM

 

Mgr. Gabriela Novotná

Mikrobiologický ústav Akademie věd ČR

 

Dr. Natalya Glavach–Hlaváčová

Pharm. Dr. Eva Šimečková

Mikrobiologické oddělení NsP

Strakonice