Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2006; 15(5): 209 – 212.

 

EHK-498 a 499  Stanovení HBV DNA a HCV RNA

Pavel Fritz

 

Datum vyzvednutí vzorků v NRL pro VH: 13.3. - 24.3.2006

Počet účastníků: 29

Počet vzorků: 6 v každé sérii  (obsah 1 vzorku cca 1.25 ml lidské plazmy)

Testované markery: HBV DNA a HCV RNA

 

 

CHARAKTERISTIKA SÉRIÍ EHK 498 A 499

            Série EHK-498 pro testování HBV-DNA a série EHK-499 pro testování HCV-RNA jsou prvními sériemi zaměřenými na tyto markery, které byly formálně zahrnuty do systému externího hodnocení kvality, organizovaného Státním zdravotním ústavem Praha. Oběma sériím předcházely v letech 1998-2004 celkem tři akce podobného charakteru, které jako pilotní organizovala sama Národní referenční laboratoř pro virové hepatitidy (NRL pro VH). Tyto akce byly na rozdíl od nynější kontroly neplacené, současně však nevedly k získání oficiálního certifikátu, který laboratoře obdrží ve standardní podobě na konci roku.

 

            Obě série tvořilo shodně 6 vzorků, z nichž 3 byly pozitivní s odstupňovanou koncentrací viru a 3 negativní. Správné stanovení všech 3 negativních a 2 silnějších pozitivních vzorků bylo pro laboratoře povinné, nejslabší pozitivní vzorek sloužil pouze jako indikátor citlivosti použitých metod a nebyl součástí bodového hodnocení (při 2 bodech za správný výsledek to znamenalo maximální zisk 10 bodů u každého markeru). Pozitivní vzorky byly připraveny jako ředící řada stejného výchozího materiálu v negativní lidské plazmě.

 

Vedle citlivosti testů byly vzorky určeny rovněž k posouzení správné kvantifikace hodnot u těch laboratoří, které pracují s kvantitativními metodami. Správná kvantifikace výsledků nebyla součástí bodového ani celkového hodnocení a sloužila pouze k ověření kvality vlastních postupů pro samotné laboratoře. Kvantitativní hodnoty získané laboratořemi u jednotlivých vzorků jsou prezentovány v tabulkách 2 a 3. Národní referenční laboratoř nebere své vlastní hodnoty jako standard pro posuzování přesnosti a uvádí je v tabulkách mezi ostatními pod pořadovým číslem 1.

 

Dalším prověřovaným prvkem byla schopnost laboratoří nevykazovat falešně reaktivní výsledky u negativních vzorků. Vzhledem k citlivosti metody PCR na kontaminaci v předamplifikačních fázích se jedná o jeden z nejdůležitějších prvků. V prvních dvou kontrolních akcích z let 1998/1999 a 2000/2001 představovaly falešné reaktivity 100% zaznamenaných chyb. Příčinu lze vidět zejména v tom, že vedle negativních vzorků byly součástí těchto kontrol pouze silně pozitivní vzorky, které dokázali zachytit všichni účastníci. Teprve ve třetí kontrolní akci z roku 2004, kdy byly zařazeny rovněž středně a slabě pozitivní vzorky, se objevily vedle falešných reaktivit i falešné negativity, způsobené laboratorní chybou nebo nízkou citlivostí použité metody.

 

Aby referenční laboratoř předešla případným námitkám ohledně kontaminace zaslaného materiálu, jsou všechny 3 negativní vzorky rozplněny ze stejné plazmy. Pokud laboratoř vykáže u jednoho negativního vzorku reaktivitu a u zbývajících dvou negativitu, je chyba zjevně na její straně, neboť se jednalo o stejný materiál.    

 

Skutečnost, že vzorky byly určeny pro stanovení citlivosti a kvantitativní hodnocení, znamenalo zvýšené nároky na jejich transport, neboť opakované rozmražení materiálu může ovlivnit jeho vlastnosti. Z tohoto důvodu bylo nutné, aby si laboratoře sami zajistily odvoz vzorků na suchém ledu z NRL pro VH. Využití kurýrní firmy specializované na transport infekčního materiálu by celou akci pro účastníky neúměrně prodražilo. Již takto jsou obě série nejdražší ze současné nabídky SZÚ, a to přesto, že NRL-VH stlačila cenu na hranici nákladů. Důvodem je nejen samotná cena vyšetření, provedených při screeningu materiálu a přípravě vzorků, ale zejména relativně nízký počet laboratoří, které si toto specializované vyšetření objednaly, a mezi které je třeba náklady rozdělit (23 laboratoří pro HBV a 26 pro HCV oproti např. 200 laboratořím u série „HIV, HBsAg, HCV“).

 

VÝSLEDKY SÉRIÍ EHK-498 A EHK-499 

 

Sériií EHK-498 a 499 se účastnilo celkem 29 laboratoří, z nichž 3 vyšetřovaly pouze HBV-DNA, 6 pouze HCV-RNA a 20 oba markery.

 

Jediným nebodovaným vzorkem v každé sérii, byl nejslabší pozitivní vzorek, který sloužil jako indikátor citlivosti použitých testů. U markeru HBV-DNA (EHK498) se jednalo o vzorek č. 3,  u markeru HCV-RNA (EHK-499) o vzorek č. 1. Oba vzorky se vyznačovaly stejnou řádovou koncentrací cílového markeru okolo 102 IU/ml (blíže tab.2 - 3). Vzorek číslo 3 u HBV-DNA označilo za pozitivní 19 laboratoří (83%), za hraniční 1 laboratoř a za negativní 3 laboratoře. Vzorek číslo 1 u HCV-RNA označilo za pozitivní 18 laboratoří (69%) a za negativní 8 laboratoří.

 

U zbývajících 5 vzorků v obou sériích znamenala každá chyba ztrátu 2 bodů. Méně chyb se vyskytlo při testování HBV-DNA, kde zaznamenaly problémy pouze 2 laboratoře.

 

Laboratoř 7 nemohla vykázat výsledek u vzorku 2 pro opakovanou inhibici interní kontroly. Tento problém znamenal pro účastníka postih v hodnocení, neboť systém EHK neposkytuje prostor k toleranci chybějícího výsledku (stejně tak obdobné systémy kontrolních vzorků organizované v zahraničí neznají možnost nevyšetření z technických důvodů). Žádná další laboratoř problémy s inhibicí neohlásila.

           

Laboratoř 20 vykázala falešnou negativitu u středně silně pozitivního vzorku 2 a falešnou reaktivitu u negativního vzorku 5. V tomto případě nelze rozhodnout, zda se opravdu jednalo o dva nesprávné výsledky, nebo o záměnu vzorků při vyšetření (případně při zápisu výsledků do formuláře). Laboratoř jako jediná nepoužila metodu PCR, ale hybridizaci Digene. Tato metoda, založená na přímé detekci cílového markeru bez amplifikace, je méně citlivá než PCR a její užívání v ČR již končí.

           

Při testování HCV-RNA chybovalo celkem 6 laboratoří, z toho 2 vykázaly po jednom falešně pozitivním výsledku a zbylé 4 po jednom falešně negativním výsledku. V případě falešně negativních výsledků se shodně jednalo o středně silný vzorek 2, nezachycený zřejmě v důsledku nízké citlivosti použitých metod (vzorek obsahoval řádovou koncentraci cílového markeru okolo 103 IU/ml).

           

Celkově tedy vykázalo problematický výsledek (bez započtení výsledků u nejslabších pozitivních vzorků) 8 laboratoří (28% z 29 zúčastněných), z toho 2 u HBV-DNA (9% z 23 vyšetřujících tento marker) a 6 u HCV-RNA (23% z 26 vyšetřujících tento marker). Žádná z laboratoří nechybovala současně u obou markerů. Uvedená procenta nezahrnují NRL pro VH, přestože v tabulkách 1-3 jsou její výsledky uvedeny (pod pořadovým číslem 1).

            Kvantitativní hodnoty u HBV-DNA uvedlo 15 laboratoří (65% z 23 vyšetřujících tento marker), u HCV-RNA 13 laboratoří (50% z 26 vyšetřujících tento marker). Při kvantifikaci byly použity různé jednotky, přičemž některé laboratoře vykázaly výsledky ve dvou různých jednotkách současně. Kvantitativní výsledky laboratoří shrnují tabulky 2 a 3. Z tabulek je zřejmé, že vzájemný rozptyl výsledků u většiny laboratoří příliš nepřesahuje hodnotu  + půl řádu, což je pro klinické potřeby postačující. Výjimky jsou spíše ojedinělé (například laboratoř 24 mírně nadhodnocuje hodnoty HCV-RNA, zatímco laboratoř 17 o něco výrazněji podhodnocuje hodnoty HBV-DNA).

           

Podle zavedeného systému EHK obdrží laboratoře na konci roku 2 osvědčení. Tím prvním je potvrzení o zapojení do systému kontroly, které získávají všichni účastníci. Tím druhým je certifikát o úspěšné účasti, určený pouze laboratořím, které při hodnocení uspěly. V EHK- 498 a 499 znamenala každá chyba u některého z 5 bodovaných vzorků hodnocení „neuspěla“. Vzhledem k nákladnosti vyšetření a skutečnosti, že mnohé laboratoři si vzorky objednaly především pro vlastní kontrolu, není organizována žádná plošná opravná série. Laboratoře, které neuspěly se však mohou v případě zájmu dohodnout s NRL pro VH na individuálním zaslání opravných vzorků. Problém s tímto řešením nastává pouze u pracovišť, kde příčinou neúspěšného hodnocení nebyla laboratorní chyba nebo technický problém, ale nízká citlivost metody. V tomto případě zřejmě nemá opakované vyšetření význam.

 

 

Tabulka 1: VÝSLEDKY LABORATOŘÍ (EHK498/499)

 

LAB.

HBV-DNA

HCV-RNA

 

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

 

+++

++

+

N

N

N

+

++

+++

N

N

N

1

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

2

P

P

P

N

N

N

-

-

-

-

-

-

3

P

P

P

N

N

N

-

-

-

-

-

-

4

P

P

P

N

N

N

N

N

P

N

N

N

5

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

6

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

7

P

inh.

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

8

-

-

-

-

-

-

N

P

P

N

N

N

9

P

P

N

N

N

N

N

N

P

N

N

N

10

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

11

P

P

P

N

N

N

N

P

P

N

N

N

12

P

P

P

N

N

N

N

N

P

N

N

N

13

-

-

-

-

-

-

N

P

P

N

N

N

14

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

15

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

16

P

P

P

N

N

N

N

N

P

N

N

N

17

P

P

N

N

N

N

P

P

P

N

N

N

18

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

19

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

20

P

N

N

N

P

N

-

-

-

-

-

-

21

-

-

-

-

-

-

N

P

P

N

N

N

22

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

23

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

24

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

25

-

-

-

-

-

-

P

P

P

N

N

N

26

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

N

27

-

-

-

-

-

-

P

P

P

N

N

N

28

P

P

P

N

N

N

P

P

P

N

N

P

29

P

P

H

N

N

N

P

P

P

N

N

N

30

-

-

-

-

-

-

P

P

P

N

P

N

 

 

Tabulka 1 prezentuje souhrnné výsledky všech laboratoří (P = pozitivní, N = negativní, H = hraniční, inh. = inhibice). V záhlaví tabulky je uveden cílový marker, číslo vzorku a správný výsledek (pozitivní vzorky jsou v záhlaví prezentovány jedním až třemi křížky podle koncentrace cílového markeru).

Problematické výsledky jsou vybarveny šedě. Nepodtržené písmeno v šedém poli znamená  nezachycení nejslabšího pozitivního vzorku, což nebylo hodnoceno jako chybné (dokládá však nižší citlivost testu), podtržené písmeno signalizuje chybu, za kterou byly laboratoři odejmuty body.

Vzorky nebyly individuálně kódovány, takže jejich čísla v tabulce jsou shodná s čísly, pod kterými je laboratoře vyšetřovaly. Pořadová čísla laboratoří v tabulce nemají souvislost s jejich kódy v EHK (NRL pro VH zde uvedena pod č.1).

 

 

 

Tabulka 2: VÝSLEDKY HBV-DNA U LABORATOŘÍ, KTERÉ SVÉ HODNOTY KVANTIFIKOVALY

 

LAB.

1

2

3

4

5

6

jednotky

1

3,34e6

3,34e4

3,17e2

-

-

-

IU/ml

2

1,95e6

4,24e4

3,81e2

-

-

-

IU/ml

5

9,04e5

1,03e4

1,09e2

-

-

-

IU/ml

6

2,69e6

4,89e4

2,14e2

-

-

-

IU/ml

7

7,86e5

inhib.

5,00e1

-

-

-

IU/ml

10

3,18e5

3,49e4

3,73e2

-

-

-

IU/ml

17

2,60e4

5,00e2

-

-

-

-

IU/ml

19

9,30e5

5,10e3

5,00e1

-

-

-

IU/ml

23

5,86e6

5,48e4

8,44e2

-

-

-

IU/ml

28

1,60e5

5,20e3

3,35e1

-

-

-

IU/ml

1

1,76e7

1,76e5

1,67e3

-

-

-

cp/ml

2

1,09e7

2,37e5

2,14e3

-

-

-

cp/ml

6

4,25e7

6,91e5

2,66e3

-

-

-

cp/ml

9

3,73e6

4,90e4

-

-

-

-

cp/ml

14

8,70e7

3,30e5

1,20e3

-

-

-

cp/ml

24

3,30e6

1,20e5

1,10e4

-

-

-

cp/ml

22

2,87e7

6,32e5

3,74e3

-

-

-

??

4

9,80e6

1,20e5

2,10e3

-

-

-

GEq/ml

20

43

-

-

-

17,6

-

pg/ml

 

 

 

 

 

 

 

 

Tabulka 3: VÝSLEDKY HCV-RNA U LABORATOŘÍ, KTERÉ SVÉ HODNOTY KVANTIFIKOVALY

 

LAB.

1

2

3

4

5

6

jednotky

1

1,41e2

3,75e3

3,89e5

-

-

-

IU/ml

5

1,54e2

1,66e3

1,35e5

-

-

-

IU/ml

6

<500

1,21e3

2,10e5

-

-

-

IU/ml

7

2,50e2

3,60e3

1,32e5

-

-

-

IU/ml

17

3,33e2

1,67e3

4,83e4

-

-

-

IU/ml

19

8,60e1

3,10e2

4,30e4

-

-

-

IU/ml

21

<600

2,33e3

4,33e5

<600

<600

<600

IU/ml

23

3,07e2

4,44e3

1,73e5

-

-

-

IU/ml

24

1,00e3

1,70e4

5,30e5

-

-

-

IU/ml

25

<600

2,40e3

3,51e5

-

-

-

IU/ml

28

3,69e2

4,40e2

1,72e4

-

-

6,71e1

IU/ml

9

-

-

2,12e6

-

-

-

cp/ml

13

-

1,33e3

2,93e4

-

-

-

cp/ ?

30

7,56e2

1,71e3

2,31e4

-

7,97e3

-

??

 

Tab. 2 a 3 prezentují výsledky těch laboratoří, které provádějí kvantitativní vyšetření. Tabulky jsou rozděleny do několika oddílů, podle použitých jednotek. Pokud laboratoř uvedla výsledky ve dvou různých jednotkách, objeví se v tabulce dvakrát. V některých případech informace o jednotkách u kvantitativního výsledku chybí.

         Výsledky NRL pro VH jsou v obou tabulkách uvedeny pod č.1.

 

 

Mgr. Pavel Fritz

NRL pro virové hepatitidy

SZÚ-CEM