Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 2006; 15(5): 209 – 212.
EHK-
Pavel Fritz
Datum vyzvednutí vzorků v NRL pro VH: 13.3. - 24.3.2006
Počet účastníků: 29
Počet vzorků: 6 v každé sérii (obsah 1 vzorku cca 1.25 ml lidské plazmy)
Testované markery: HBV DNA a HCV RNA
CHARAKTERISTIKA SÉRIÍ
EHK
Série EHK-498 pro testování HBV-DNA a série EHK-499 pro testování HCV-RNA jsou prvními sériemi zaměřenými na tyto markery, které byly formálně zahrnuty do systému externího hodnocení kvality, organizovaného Státním zdravotním ústavem Praha. Oběma sériím předcházely v letech 1998-2004 celkem tři akce podobného charakteru, které jako pilotní organizovala sama Národní referenční laboratoř pro virové hepatitidy (NRL pro VH). Tyto akce byly na rozdíl od nynější kontroly neplacené, současně však nevedly k získání oficiálního certifikátu, který laboratoře obdrží ve standardní podobě na konci roku.
Obě série tvořilo shodně 6 vzorků, z nichž 3 byly pozitivní s odstupňovanou koncentrací viru a 3 negativní. Správné stanovení všech 3 negativních a 2 silnějších pozitivních vzorků bylo pro laboratoře povinné, nejslabší pozitivní vzorek sloužil pouze jako indikátor citlivosti použitých metod a nebyl součástí bodového hodnocení (při 2 bodech za správný výsledek to znamenalo maximální zisk 10 bodů u každého markeru). Pozitivní vzorky byly připraveny jako ředící řada stejného výchozího materiálu v negativní lidské plazmě.
Vedle citlivosti testů byly
vzorky určeny rovněž k posouzení správné kvantifikace hodnot u těch laboratoří,
které pracují s kvantitativními metodami. Správná kvantifikace výsledků
nebyla součástí bodového ani celkového hodnocení a sloužila pouze
k ověření kvality vlastních postupů pro samotné laboratoře. Kvantitativní
hodnoty získané laboratořemi u jednotlivých vzorků jsou prezentovány v tabulkách
Dalším prověřovaným prvkem byla schopnost laboratoří nevykazovat falešně reaktivní výsledky u negativních vzorků. Vzhledem k citlivosti metody PCR na kontaminaci v předamplifikačních fázích se jedná o jeden z nejdůležitějších prvků. V prvních dvou kontrolních akcích z let 1998/1999 a 2000/2001 představovaly falešné reaktivity 100% zaznamenaných chyb. Příčinu lze vidět zejména v tom, že vedle negativních vzorků byly součástí těchto kontrol pouze silně pozitivní vzorky, které dokázali zachytit všichni účastníci. Teprve ve třetí kontrolní akci z roku 2004, kdy byly zařazeny rovněž středně a slabě pozitivní vzorky, se objevily vedle falešných reaktivit i falešné negativity, způsobené laboratorní chybou nebo nízkou citlivostí použité metody.
Aby referenční laboratoř předešla případným námitkám ohledně kontaminace zaslaného materiálu, jsou všechny 3 negativní vzorky rozplněny ze stejné plazmy. Pokud laboratoř vykáže u jednoho negativního vzorku reaktivitu a u zbývajících dvou negativitu, je chyba zjevně na její straně, neboť se jednalo o stejný materiál.
Skutečnost, že vzorky byly určeny pro stanovení citlivosti a kvantitativní hodnocení, znamenalo zvýšené nároky na jejich transport, neboť opakované rozmražení materiálu může ovlivnit jeho vlastnosti. Z tohoto důvodu bylo nutné, aby si laboratoře sami zajistily odvoz vzorků na suchém ledu z NRL pro VH. Využití kurýrní firmy specializované na transport infekčního materiálu by celou akci pro účastníky neúměrně prodražilo. Již takto jsou obě série nejdražší ze současné nabídky SZÚ, a to přesto, že NRL-VH stlačila cenu na hranici nákladů. Důvodem je nejen samotná cena vyšetření, provedených při screeningu materiálu a přípravě vzorků, ale zejména relativně nízký počet laboratoří, které si toto specializované vyšetření objednaly, a mezi které je třeba náklady rozdělit (23 laboratoří pro HBV a 26 pro HCV oproti např. 200 laboratořím u série „HIV, HBsAg, HCV“).
VÝSLEDKY SÉRIÍ EHK-
Sériií EHK-
Jediným nebodovaným vzorkem v každé sérii, byl nejslabší pozitivní vzorek, který sloužil jako indikátor citlivosti použitých testů. U markeru HBV-DNA (EHK498) se jednalo o vzorek č. 3, u markeru HCV-RNA (EHK-499) o vzorek č. 1. Oba vzorky se vyznačovaly stejnou řádovou koncentrací cílového markeru okolo 102 IU/ml (blíže tab.2 - 3). Vzorek číslo 3 u HBV-DNA označilo za pozitivní 19 laboratoří (83%), za hraniční 1 laboratoř a za negativní 3 laboratoře. Vzorek číslo 1 u HCV-RNA označilo za pozitivní 18 laboratoří (69%) a za negativní 8 laboratoří.
U zbývajících 5 vzorků v obou sériích znamenala každá chyba ztrátu 2 bodů. Méně chyb se vyskytlo při testování HBV-DNA, kde zaznamenaly problémy pouze 2 laboratoře.
Laboratoř 7 nemohla vykázat výsledek u vzorku 2 pro opakovanou inhibici interní kontroly. Tento problém znamenal pro účastníka postih v hodnocení, neboť systém EHK neposkytuje prostor k toleranci chybějícího výsledku (stejně tak obdobné systémy kontrolních vzorků organizované v zahraničí neznají možnost nevyšetření z technických důvodů). Žádná další laboratoř problémy s inhibicí neohlásila.
Laboratoř 20 vykázala falešnou
negativitu u středně silně pozitivního vzorku
Při testování HCV-RNA chybovalo celkem 6 laboratoří, z toho 2 vykázaly po jednom falešně pozitivním výsledku a zbylé 4 po jednom falešně negativním výsledku. V případě falešně negativních výsledků se shodně jednalo o středně silný vzorek 2, nezachycený zřejmě v důsledku nízké citlivosti použitých metod (vzorek obsahoval řádovou koncentraci cílového markeru okolo 103 IU/ml).
Celkově tedy vykázalo problematický výsledek (bez započtení výsledků u nejslabších pozitivních vzorků) 8 laboratoří (28% z 29 zúčastněných), z toho 2 u HBV-DNA (9% z 23 vyšetřujících tento marker) a 6 u HCV-RNA (23% z 26 vyšetřujících tento marker). Žádná z laboratoří nechybovala současně u obou markerů. Uvedená procenta nezahrnují NRL pro VH, přestože v tabulkách 1-3 jsou její výsledky uvedeny (pod pořadovým číslem 1).
Kvantitativní
hodnoty u HBV-DNA uvedlo 15 laboratoří (65% z 23 vyšetřujících tento
marker), u HCV-RNA 13 laboratoří (50% z 26 vyšetřujících tento marker).
Při kvantifikaci byly použity různé jednotky, přičemž některé laboratoře
vykázaly výsledky ve dvou různých jednotkách současně. Kvantitativní výsledky
laboratoří shrnují tabulky
Podle zavedeného systému EHK
obdrží laboratoře na konci roku 2 osvědčení. Tím prvním je potvrzení o zapojení
do systému kontroly, které získávají všichni účastníci. Tím druhým je
certifikát o úspěšné účasti, určený pouze laboratořím, které při hodnocení
uspěly. V EHK-
Tabulka 1:
VÝSLEDKY LABORATOŘÍ (EHK498/499)
LAB. |
HBV-DNA |
HCV-RNA |
||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
+++ |
++ |
+ |
N |
N |
N |
+ |
++ |
+++ |
N |
N |
N |
1 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
2 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
3 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
4 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
N |
N |
P |
N |
N |
N |
5 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
6 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
7 |
P |
inh. |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
8 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
N |
P |
P |
N |
N |
N |
9 |
P |
P |
N |
N |
N |
N |
N |
N |
P |
N |
N |
N |
10 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
11 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
N |
P |
P |
N |
N |
N |
12 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
N |
N |
P |
N |
N |
N |
13 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
N |
P |
P |
N |
N |
N |
14 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
15 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
16 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
N |
N |
P |
N |
N |
N |
17 |
P |
P |
N |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
18 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
19 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
20 |
P |
N |
N |
N |
P |
N |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
21 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
N |
P |
P |
N |
N |
N |
22 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
23 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
24 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
25 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
26 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
27 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
28 |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
P |
29 |
P |
P |
H |
N |
N |
N |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
30 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
P |
P |
P |
N |
P |
N |
Tabulka 1 prezentuje souhrnné
výsledky všech laboratoří (P = pozitivní, N = negativní, H = hraniční, inh. =
inhibice). V záhlaví tabulky je uveden cílový marker, číslo vzorku a
správný výsledek (pozitivní vzorky jsou v záhlaví prezentovány jedním až
třemi křížky podle koncentrace cílového markeru).
Problematické
výsledky jsou vybarveny šedě. Nepodtržené písmeno v šedém poli
znamená nezachycení nejslabšího
pozitivního vzorku, což nebylo hodnoceno jako chybné (dokládá však nižší
citlivost testu), podtržené písmeno signalizuje chybu, za kterou byly
laboratoři odejmuty body.
Vzorky
nebyly individuálně kódovány, takže jejich čísla v tabulce jsou shodná
s čísly, pod kterými je laboratoře vyšetřovaly. Pořadová čísla laboratoří v tabulce
nemají souvislost s jejich kódy v EHK (NRL pro VH zde uvedena pod
č.1).
Tabulka 2:
VÝSLEDKY HBV-DNA U LABORATOŘÍ, KTERÉ SVÉ HODNOTY KVANTIFIKOVALY
LAB. |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
jednotky |
1 |
3,34e6 |
3,34e4 |
3,17e2 |
- |
- |
- |
IU/ml |
2 |
1,95e6 |
4,24e4 |
3,81e2 |
- |
- |
- |
IU/ml |
5 |
9,04e5 |
1,03e4 |
1,09e2 |
- |
- |
- |
IU/ml |
6 |
2,69e6 |
4,89e4 |
2,14e2 |
- |
- |
- |
IU/ml |
7 |
7,86e5 |
inhib. |
5,00e1 |
- |
- |
- |
IU/ml |
10 |
3,18e5 |
3,49e4 |
3,73e2 |
- |
- |
- |
IU/ml |
17 |
2,60e4 |
5,00e2 |
- |
- |
- |
- |
IU/ml |
19 |
9,30e5 |
5,10e3 |
5,00e1 |
- |
- |
- |
IU/ml |
23 |
5,86e6 |
5,48e4 |
8,44e2 |
- |
- |
- |
IU/ml |
28 |
1,60e5 |
5,20e3 |
3,35e1 |
- |
- |
- |
IU/ml |
1 |
1,76e7 |
1,76e5 |
1,67e3 |
- |
- |
- |
cp/ml |
2 |
1,09e7 |
2,37e5 |
2,14e3 |
- |
- |
- |
cp/ml |
6 |
4,25e7 |
6,91e5 |
2,66e3 |
- |
- |
- |
cp/ml |
9 |
3,73e6 |
4,90e4 |
- |
- |
- |
- |
cp/ml |
14 |
8,70e7 |
3,30e5 |
1,20e3 |
- |
- |
- |
cp/ml |
24 |
3,30e6 |
1,20e5 |
1,10e4 |
- |
- |
- |
cp/ml |
22 |
2,87e7 |
6,32e5 |
3,74e3 |
- |
- |
- |
?? |
4 |
9,80e6 |
1,20e5 |
2,10e3 |
- |
- |
- |
GEq/ml |
20 |
43 |
- |
- |
- |
17,6 |
- |
pg/ml |
Tabulka 3:
VÝSLEDKY HCV-RNA U LABORATOŘÍ, KTERÉ SVÉ HODNOTY KVANTIFIKOVALY
LAB. |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
jednotky |
1 |
1,41e2 |
3,75e3 |
3,89e5 |
- |
- |
- |
IU/ml |
5 |
1,54e2 |
1,66e3 |
1,35e5 |
- |
- |
- |
IU/ml |
6 |
<500 |
1,21e3 |
2,10e5 |
- |
- |
- |
IU/ml |
7 |
2,50e2 |
3,60e3 |
1,32e5 |
- |
- |
- |
IU/ml |
17 |
3,33e2 |
1,67e3 |
4,83e4 |
- |
- |
- |
IU/ml |
19 |
8,60e1 |
3,10e2 |
4,30e4 |
- |
- |
- |
IU/ml |
21 |
<600 |
2,33e3 |
4,33e5 |
<600 |
<600 |
<600 |
IU/ml |
23 |
3,07e2 |
4,44e3 |
1,73e5 |
- |
- |
- |
IU/ml |
24 |
1,00e3 |
1,70e4 |
5,30e5 |
- |
- |
- |
IU/ml |
25 |
<600 |
2,40e3 |
3,51e5 |
- |
- |
- |
IU/ml |
28 |
3,69e2 |
4,40e2 |
1,72e4 |
- |
- |
6,71e1 |
IU/ml |
9 |
- |
- |
2,12e6 |
- |
- |
- |
cp/ml |
13 |
- |
1,33e3 |
2,93e4 |
- |
- |
- |
cp/ ? |
30 |
7,56e2 |
1,71e3 |
2,31e4 |
- |
7,97e3 |
- |
?? |
Tab.
Výsledky
NRL pro VH jsou v obou tabulkách uvedeny pod č.1.
NRL pro virové hepatitidy
SZÚ-CEM