Zprávy
CEM (SZÚ, Praha) 2005; 14(12): 510 – 514.
Doporučené metody pro
diagnostiku Chlamydia trachomatis
![]()
Recommended
methods for diagnosis of Chlamydia trachomatis
Kateřina Roubalová, Ljuba Janečková
Souhrn · Summary
Chlamydia
trachomatis je pohlavně přenosný patogen, schopný vyvolat chronické záněty
močopohlavního ústrojí u mužů i u žen, které mohou mít trvalé závažné zdravotní
následky, např. neplodnost, mimoděložní těhotenství, zvýšené riziko potratu, či
předčasného porodu u žen, novorozeneckých konjunktivitid, či pneumonií
souvisejících s perinatálním přenosem infekce z matky na dítě nebo
Reiterova syndromu. Proto ECDC doporučilo zařazení těchto infekcí mezi hlášené
sexuálně přenosné choroby. Cílem toho příspěvku je podat přehled o současných
možnostech laboratorního průkazu těchto infekcí, zhodnotit jejich diagnostický
přínos, výhody a nedostatky a způsob interpretace laboratorních nálezů.
Klíčová
slova: Chlamydia trachomatis, laboratorní diagnostika
Chlamydia
trachomatis is a sexually transmitted
pathogen implicated in chronic genitourinary tract inflammation in both men and
women with possible permanent serious health consequences such as infertility, extrauterine pregnancy, increased risk of miscarriage or pre-term
labor, neonatal conjunctivitis or pneumonia due to mother-to-child transmission
and Reiter syndrome. ECDC recommended listing these infections among reportable
sexually transmitted diseases. The goals of this communication are to present
the state of the art in laboratory detection of these infections and to compare
the available methods for their diagnostic benefit, advantages and limitations
and interpretation of laboratory results.
Key
words: Chlamydia trachomatis, laboratory diagnosis
ÚVOD
Chlamydie jsou obligatorní intracelulární paraziti, patřící mezi gram-negativní bakterie. Do rodu Chlamydia patří 3 významné lidské patogeny : Chlamydia trachomatis, Chlamydia (dle nové nomenklatury Chlamydophyla) pneumonie a Chlamydia (Chlamydophyla) psittaci.
Chlamydia trachomatis se vyskytuje v 18ti sérotypech: sérotypy D-K jsou původci infekcí urogenitálního traktu u žen i mužů a očních zánětů u dětí i dospělých [9]. Výskyt těchto sérotypů je kosmopolitní. Urogenitální infekce probíhají většinou asymptomaticky [8], mohou však přejít do chronicity a způsobit záněty močopohlavního ústrojí (cervicitidy, endometritidy, salpingitidy u žen, uretritidy, epididymitidy u mužů), které mohou progredovat do okolních tkání (proktitidy, perihepatitidy, arthritidy) [15]. Důsledkem chronických zánětů v malé pánvi může být ektopické těhotenství nebo neplodnost. Konjunktivitidy jsou časté zvláště u novorozenců, kde jsou důsledkem perinatálního přenosu infekce při průchodu porodními cestami. Asi u 10% takto infikovaných novorozenců se následně může rozvinout pneumonie [5]. Kombinovaný zánět uretry, spojivky a kloubů je u mužů (a méně často i u žen) znám jako Reiterův syndrom [15].
V tropických oblastech vyvolává C.trachomatis (sérotypy L1-3) systemické pohlavně přenosné onemocnění lymfogranuloma venereum a sérotypy A, B, Ba a C C.trachomatis jsou původci těžké pyogenní keratokonjunktivitidy u dětí (trachom) [20].
Infekce C.trachomatis má být zařazena mezi povinně hlášené pohlavní přenosné nemoci. Cílem tohoto přehledu je sjednocení přístupu k laboratorní diagnostice těchto infekcí.
EPIDEMIOLOGIE
C.trachomatis je nejčastěji se vyskytujícím sexuálně přenosným bakteriálním infekčním agens. Vstupní branou infekce mohou být i spojivky nebo nosohltan. Prevalence infekce se pohybuje okolo 3%, je podobná u žen i mužů a je závislá na věku: V rizikových věkových kategoriích 15-25 let je incidence několikanásobně vyšší (10-25%). Kromě věku je rizikovým faktorem rovněž promiskuitní sexuální chování: pacienti STD klinik mají výrazně vyšší výskyt infekce v porovnání s běžnou populací. Zvýšený výskyt infekcí v rizikových skupinách je ovlivněn a) vyšší vnímavostí mladších jedinců k infekci b) vyšší frekvencí reinfekcí, c) častějším výskytem koinfekcí s dalšími sexuálně přenosnými infekčními agens [13]. Riziko vertikálního přenosu infekce z matky na dítě je 40-60%, vyšší je u předčasně narozených dětí a snižuje se při porodu císařským řezem [5].
Séroprevalence C. trachomatis v ČR dosahovala v běžné dospělé populaci až 20-40% [16]. Prevalence infekce v genitourinárním traktu žen podstupujících přerušení těhotenství byla 5,2%, ve věkové kategorii 16-19 let až 16% [9].
Metody laboratorní diagnostiky infekce Chlamydia trachomatis
Přímý průkaz bakterií
Indikace vyšetření, odběr klinického materiálu:
Urogenitální infekce u žen – endocervikální výtěr, vaginální výtěr,
moč (pouze pro amplifikační techniky průkazu)
Urogenitální infekce u mužů – uretrální výtěr, moč
Infekce očí - výtěr ze spojivkového vaku
Infekce dolních cest dýchacích – sputum, aspirát nebo BAL
Při pozitivním nálezu urogenitální infekce se doporučuje i vyšetření sexuálního partnera. U laboratorně prokázaných novorozeneckých konjunktivitd, či zánětů dýchacích cest se doporučuje zároveň vyšetřit možnou přítomnost urogenitální infekce u matky [1, 2, 3].
Způsob odběru a transport
Výtěry se
provádí suchým sterilním tamponem (dacron, bavlna na plastové tyčince, dřevěné
špejle jsou nevhodné pro kultivační metody), který se vkládá do transportního
media, vhodného pro příslušnou metodu detekce (viz dále). Doporučuje se
používat komerčně dostupné speciální stírací materiály pro průkaz chlamydií,
nebo cytokartáčky. Výtěr je nutno provést abrazivním způsobem tak, aby bylo zachyceno dostatečné množství
infikovaných buněk. Při odběru z endocervixu je nutno napřed odstranit
hlen, zavést tampon aspoň
Zhotovení otiskového
preparátu: tampon otiskneme valivým pohybem na čisté mikroskopické
sklíčko (nejvhodnější jsou sklíčka určená pro IF testy), necháme zaschnout při
pokojové teplotě a fixujeme 96% etanolem 5 min při pokojové teplotě. Sklíčko
skladujeme v suchu (v uzavřeném kontejneru) při 2-
Moč:
Odebírá se 10-15 ml ranní moče (první proud) do sterilní nádobky. Odběr se
provádí bez předchozí očisty rodidel, či
okolí vývodu močové trubice. Vzorek se skladuje v uzavřené nádobce při 2-
Průkaz Chlamydia trachomatis kultivací na tkáňových kulturách
Materiál: endocervikální výtěr u žen, uretrální výtěr u mužů, konjunktivální výtěr u onemocnění oka. Transport v mediu, vhodném pro izolace chlamydií, např. 2SP, SPG. Lze použít i kultivační medium (viz níže), ale bez cykloheximidu.
Princip a
provedení testu: Chlamydie se
množí in vitro na lidských nebo opičích epiteliálních buňkách. Tampon se razantně
vytřepe do transportního media (vortex)
a odstraní. Medium se setřeným materiálem se použije k inokulaci
citlivých epiteliálních buněk, např. McCoy nebo BGMK: Používají se kultury, narostlé do monovrstvy na krycím
sklíčku ve zkumavkách s rovným dnem (Shell vials), nebo
v kultivačních destičkách. Citlivost testu se zvyšuje centrifugací inokula
na monovrstvu buněk 45 min. při 2500-3000g a
Chlamydie se prokazují po fixaci monovrstvy metanolem 5 min
při +
Citlivost metody:V porovnání s PCR 60-85%, podle druhu materiálu.
Specifita: 100% [1, 2, 3].
Průkaz antigenu
Přímý cytologický průkaz (direct fluorescence assay, DFA):
Otiskové preparáty z výtěrů (zhotovení – viz výše), nebo cytospinové preparáty z výtěrů, vytřepaných do transportního média, fixované 96% etanolem 5 min. při pokojové teplotě. (Vyšetřování močového sedimentu touto metodou je málo citlivé i specifické.)
Princip a provedení testu: Antigen C.trachomatis (lipopolysacharid -LPS, rodově společný pro všechny chlamydie, nebo hlavní membránový protein – MOMP druhově specifický) lze prokázat otiskových nebo cytospinových preparátech z klinického materiálu pomocí imunohistochemického barvení (metodou přímé imunofluorescence s použitím myší monoklonální protilátky proti detekovanému antigenu, značené FITC. K dispozici jsou komerční kity.
Citlivost a specifita se liší podle použitého antigenu, druhu a kvality vyšetřovaného materiálu. Udává se citlivost o něco nižší, než u kultivace (70-85%). Detekce MOMP je specifičtější než detekce LPS (možnost křížové reaktivity s ostatními chlamydiemi ). U screeningových vyšetření a vyšetření asymptomatických jedinců v populaci s nízkou prevalencí infekce je prediktivní hodnota pozitivního výsledku testu nízká, a proto se doporučuje konfirmační test, dodávaný výrobcem kitu.
Imunohistochemický průkaz pomocí EIA
Materiál: Výtěry (transport a zpracování podle instrukcí výrobce kitu), močový sediment.
Princip a provedení testu: Používají se komerčně dostupné kity. Z klinického materiálu se extrahuje LPS, který se prokazuje v přímé nebo nepřímé ELISA pomocí myší monoklonální protilátky.Test se provádí podle instrukcí výrobce.
Citlivost a specifita je nižší než u kultivací, a je podobná, jako u DFA. U screeningových vyšetření a vyšetření asymptomatických jedinců v populaci s nízkou prevalencí infekce je prediktivní hodnota pozitivního výsledku testu nízká. Pro možnost falešně pozitivních výsledků v důsledku zkřížené reaktivity s LPS jiných gram-negativních bakterií je nutno pozitivní nálezy konfirmovat. Jako konfirmační metodu lze použít jinou metodu přímého průkazu chlamydií nebo konfirmační test dodávaný výrobcem EIA souprav [1, 2, 3, 12].
Průkaz bakteriální
DNA
Hybridizační testy
Materiál: Výtěry, moč, transport a zpracování podle instrukcí výrobce kitu. Kontaminace krví může způsobit falešně pozitivní výsledek testu.
Princip a provedení testu: Používají se komerčně dostupné kity, např. PACE 2 (Gene-Probe).
Z klinického materiálu se extrahuje bakteriální RNA a 16Sr RNA, přítomná ve vzorku hybridizuje se DNA sondou. Vzniklé RNA-DNA hybridy jsou vychytávány na magnetické mikročástice a detekovány pomocí chemiluminiscence
Citlivost a specifita v porovnání s kultivací je
Amplifikační testy
Materiál: Amplifikační testy jsou jako jediné
dostatečně citlivé pro průkaz C.
trachomatis v neinvazivním materiálu, např. v moči nebo
vaginálních výtěrech od pacientů s urogenitální infekcí. Nejvyšší záchyt
agens je však opět v endocervikálních nebo uretrálních výtěrech. Jsou též vhodné pro průkaz chlamydií ve
sputu, aspirátu, BAL a jiných nekonvenčních materiálech. Výtěrové tampony se
transportují v mediích, dodaných výrobci diagnostických souprav, nebo
vložené do 0,5 ml sterilního pufrovaného fosfátového roztoku (PBS). Tampon je vhodné do media vytřepat a
odstranit, ponecháním tamponu v mediu delší dobu může být odběr
znehodnocen. Skladování a transport výtěrů i moči je nutný při 2-
Tampony jsou vytřepány do transportního média, které je následně, stejně jako vzorky moče, zpravidla zakoncentrováno centrifugací a bakteriální DNA extrahována vhodným lyzačním pufrem, případně purifikována. (K purifikaci se používají běžné komerčně dostupné kity a postupuje se podle instrukcí výrobce). Purifikační krok je nezbytný při průkazu DNA ve sputu, aspirátu, BAL a jiných materiálech. Silně viskózní vzorky sputa je vhodné rozpustit přidáním cystein-acetátu a protřepat na vortexu.
Princip a provedení testu: Principem testu je polymerázová řetězová reakce (PCR), při níž dochází k amplifikaci vybraného jedinečného úseku bakteriálního genomu pomocí synteticky připravených primerů a termostabilní bakteriální DNA polymerázy. Produkty reakce jsou detekovány po obarvení ethidium bromidem pomocí elektroforézy v agarózovém gelu, nebo pomocí hybridizace se značenými sondami, a to buď v průběhu reakce (real-time PCR) nebo na jejím konci (imunohistochemická detekce hybridů). Používají se buď komerční diagnostické soupravy nebo validované „home-brew“ metody.
Citlivost a specifita závisí na typu metody, typu amplifikovaného úseku, druhu a zpracování klinického materiálu. Je to nejcitlivější dostupný test, v porovnání s kultivacemi je udávána citlivost vyšší o cca 30% ( citlivost záchytu je 1-10 elementárních nebo retikulárních tělísek na reakci). Je zde však možnost falešně negativních výsledků díky přítomnosti inhibitorů PCR ve vzorku. Doporučuje se proto paralelní průkaz nepřítomnosti inhibitorů ve vzorku pomocí amplifikace vnitřního standardu (DNA, přidávané do reakční směsi), nebo vhodně vybraného úseku lidské DNA (např. genu pro b-globin, aktin apod.) Reakce, v nichž se amplifikuje úsek odvozený od kryptického plasmidu, který je v C. trachomatis přítomen v 7-10 kopiích, jsou u většiny vzorků nejcitlivější, kdežto reakce, v nichž je amplifikována genomická DNA, např. gen pro MOMP, jsou naopak nejspecifičtější .
Poznámka: Vzhledem k vysoké citlivosti testu může dojít k falešným pozitivitám vlivem kontaminace vzorku reakčními produkty, nebo přenosem materiálu z pozitivních vzorků. Proto je pro získání validních výsledků nutno dodržovat metody správné laboratorní praxe: provádění jednotlivých kroků reakce ( zpracování vzorku, příprava amplifikační směsi, amplifikace, detekce produktů) provádět v oddělených prostorách s využíváním jednorázových pomůcek (rukavice, pipetovací špičky s filtrem) a důslednou pravidelnou dekontaminací. Doporučuje se používat enzymatické systémy, které degradují vzniklé amplifikační produkty. (UTP + uracyl-glykosyláza) [2, 3, 4, 6, 7, 12, 18, 19].
Sérologické testy
Sérologické testy jsou pro diagnostiku urogenitálních infekcí u dospělých pouze pomocným kritériem s relativně nízkou diagnostickou informativní hodnotou. Negativní výsledek sérologického vyšetření nevylučuje probíhající aktivní infekci a naopak pozitivní výsledek není jejím důkazem. Při interpretaci sérologických nálezů je nutno brát v úvahu a) dlouhodobé přetrvávání protilátek v krvi pacientů po prodělané infekci (několik měsíců), b) poměrně vysokou četnost reinfekcí v dospělé populaci (nejvíce ve věkových skupinách 15-25 let), c) možnost křížové reaktivity protilátek proti jiným chlamydiím, např. C. pneumoniae, d) u akutních infekcí se protilátky v krvi nemůsí vůbec objevit (negativní protilátky proti C. trachomatis nevylučují akutní infekci urogenitálního traktu). Většinou nelze udělat závěr z jednoho vyšetření a je nutné testování párových vzorků séra s minimálním odstupem aspoň 3 týdnů [2, 3, 11, 14].
Průkaz typově specifických protilátek je základním sérologickým vyšetřením.
Prokazují se IgG, IgA a IgM protilátky proti typově specifickým antigenům, hlavně proti MOMP. Metoda mikroimunofluorescenčního testu (MIF,) je test nepřímé imunofluorescence, který se provádí na preparátech z elementárních tělísek opracovaných tak, že jsou odstraněny rodově specifické membránové antigeny a LPS. Protilátky proti C. trachomatis, C. pneumoniae a C. psittacii se prokazují současně na jednom testovacím sklíčku. Typově specifické IgG protilátky mají anamnestický charakter a prokazují se titračně. Diagnostický význam má jejich čtyřnásobný vzestup v párových vzorcích séra (oba vzorky je nutno vyšetřit ve stejném testu). Typově specifické IgA a IgM protilátky se tvoří přechodně po prodělané infekci, IgA i při reinfekci. Při provedení testu se řídíme pokyny výrobce. MIF test má v porovnání s ostatními sérologickými metodami vysokou citlivost a specifitu, jeho odečítání ve fluorescenčním mikroskopu však vyžaduje určitou zkušenost.
Druhou variantou průkazu typově specifických IgG a IgA protilátek jsou ELISA testy, které využívají rekombinantní typově specifické antigeny. Používají se komerčně dostupné testy.
Rodově specifické
protilátky jsou protilátky proti rodově specifickým antigenům (společným
pro všechny druhy chlamydií). Imunodominantním antigenem pro tvorbu rodově
specifických protilátek je bakteriální LPS. Chlamydiový LPS obsahuje krátký
úsek, který je specifický pro chlamydie a není přítomen na LPS jiných
bakteriálních druhů. V sérologických testech, které se používají pro
stanovení těchto protilátek (ELISA IgG, IgM, IgA) je použit rekombinantní LPS,
obsahující tento specifický epitop. Přesto je ale specifita těchto testů
omezená: křížovou reaktivitu s LPS ostatních bakterií, ale i
s některými lidskými lipoproteiny, nelze vyloučit. Výhodou tohoto
stanovení je, že se rodové protilátky při primoinfekci často vytváří dříve, než typově specifické
protilátky. Nevýhodou naopak je jejich dlouhodobé přetrvávání po prodělané
infekci: Rodově specifické IgA i IgM protilátky mohou v nezměněných
hladinách přetrvávat řadu měsíců. Stanovení rodově specifických protilátek lze
proto použít pouze jako doplňující vyšetření k průkazu typově specifických
protilátek.
Protilátky proti
bakteriálním proteinům tepelného šoku.
Chlamydie nesou genetickou informaci pro 3 proteiny
tepelného šoku: Hsp 10, Hsp
Hodnocení laboratorního nálezu
Jako laboratorně prokázanou infekci hodnotíme :
1) pozitivní výsledek izolace na tkáňových kulturách, spojený s identifikací/typizací izolovaného kmene pomocí detekce specifického antigenu nebo DNA
2) průkaz přítomnosti DNA C. trachomatis amplifikačním testem (PCR) nebo hybridizací.
3) průkaz chlamydiového antigenu metodou DFA nebo ELISA, doplněný konfirmačním testem
Jako suspektní infekci hodnotíme:
Přímý průkaz chlamydiového antigenu bez konfirmace
Jako suspektní probíhající nebo prodělanou infekci hodnotíme
1) sérologický nález typově specifických IgG a IgM protilátek proti C.trachomatis
2) nález vysokého titru typově specifických IgG protilátek (1:512 a výše) a současně zvýšeného titru typově specifických IgA protilátek (1:16 a výše)
3) signifikantní vzestup typově specifických IgG nebo IgA protilátek v párových vzorcích séra
V těchto případech je vhodné vyšetření doplnit přímým průkazem C. trachomatis v materiálu odebraném z postiženého orgánu. Nález rodově specifických IgG, IgA ani IgM protilátek, ani protilátek proti chlamydiovému Hsp 60 nelze považovat za průkaz infekce.
LITERATURA
1. Recomendations for the prevention and
management of Chlamydia trachomatis
infections. MMRW 1993; 42, RR-12, 1-
32.
2. Black C. Current methods of laboratory
diagnosis of Chlamydia trachomatis
infection. Clin Microbiol Rev 1997;
10: 160-184.
3. Centers for disease control and
prevention. Screening tests to detect Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoae
infections - 2002. MMRW 2002; 51,
RR-15: 1- 38.
4. Chalker V, Vaughan H, Patel P, et al.
External quality assesment for detection of Chlamydia
trachomatis. J Clin Microbiol
2005; 43: 1341-1347.
5. Darville T. Chlamydia trachomatis infections in neonates and young children. Semin Pediatr Infect Dis 2005; 16:
235-244.
6. Gaydos CA, Theodore M, Dalesio N, et
al. Comparison of three nucleic acid amplification tests for detection of Chlamydia trachomatis in urine
specimens. J Clin Microbiol 2004; 42:
3041- 3045.
7. Johnson RE, Green TA, Schachter J, Jones RB,
et al. Evaluation of nucleic acid amplification tests as reference tests for Chlamydia trachomatis infections in
asymptomatic men. J Clin Microbiol 2001;
38: 4382 - 4386.
8. LaMontagne D, Fine D, Marrazzo J. Chlamydia trachomatis infection in
asymptomatic men. Am J Prev Med 2003;
24: 36 - 42.
9. Mašata
J, Drazdakova M., Hruba D., Řezáčova J.: Prevalence of genital chlamydial infections
among young females in Prague. In: Judith Deak (Ed.) Proceedings
Fifth meeting of the European society for Chlamydia Research, 2004; September 1-4, Budapest – Hungary.
10. Morré SA, Rozendaal L, vanValkengoed
I, et al. Urogenital Chlamydia
trachomatis serovars in men and women with symptomatic and asymptomatic
infection: An association with clinical manifestation? J Clin Microbiol 2000; 38: 2292 - 2296.
11. Morré SA, Munk C, Persson K, et al. Comparison of three comercially
available peptide-based immunoglobulin G (IgG) and IgA assays to
microimmunofluorescence assay for detection of Chlamydia trachomatis antibodies. J Clin Microbiol 2002; 40: 584 - 587.
12. Nelson H, Helfand M. Screening for chlamydial infection. Am J Prev Med 2001; 20: 95-107.
13. Norman J. Epidemiology of female genital Chlamydia trachomatis infection. Best Pract Res Clin Obster Gynecol 2002; 16: 775 - 787.
14. Ossewaarde J, DeVries A, vandenHoek J, vanLoon A. Enzyme immunoassay with
enhanced specificty for detection of antibodies to Chlamydia trachomatis. J Clin
Microbiol 1994; 32: 1419
-1426.
15. Schachter J. Pathogenesis of chlamydial infections. Pathol Immunopathol Res 1989; 8: 206-220.
16. Sodja I. Serological survey
of antibodies against Chlamydiae. Zprávy CEM (SZÚ, Praha) 1998; 7,
příloha 1: 34 - 36.
17. Sziller I, Witkin S, Ziegert M, et al. Serological responses of patients
with ectopic pregnancy to epitopes of Chlamydia
trachomatis 60kDa heat shock protein. Hum
Reprod 1998; 13: 1088 - 1093.
18. VanderPol B, Quinn T,
Gaydos CA, et al. Multicenter evaluation of the Amplicor and automated COBAS
Amplicor CT/NG tests for detection of Chlamydia
trachomatis. J Clin Microbiol
2000; 38: 1105 - 1112.
19. Verkooyen R, Noordhoek G, Klapper P, et al. Reliability of nucleic acid
amplification methods for detection of Chlamydia
trachomatis in urine: results of the first international collaborative
quality control study among 96 laboratories. J Clin Microbiol 2003; 41: 3013 - 3016.
20. West S. Trachoma: new assault on an
ancient disease. Progr Ret Eye Res
2004; 23: 381 - 401.
21. Witkin S, Askienazy-Elbhar M,
Henry-Suchet J, et al. Circulating antibodies to conserved epitope of the Chlamydia trachomatis 60kDa heat shock
protein (hsp60) in infertilae couples and its relationship to antibodies to C.trachomatis surface antigens and the Escherichia coli and human HSP60. Hum Reprod 1998; 13: 1175 - 1179.
22. Yang Y, Brunham R. Autoimmunity to
heat-shock protein 60 and antigen-specific production of interleukin 10. Infect Immunity 1997; 65: 1669 - 1674.
Poděkování
Autorky děkují MUDr Daně Hrubé, MUDr Evě Žampachové a MUDr Haně Zákoucké za odborné posouzení a připomínky k textu.
Oznámení
Průkaz DNA Chlamydia trachomatis byl předmětem projektu, sponzorovaného grantem 1A/8251-3 IGA, MZ ČR.
Kateřina Roubalová,
Ljuba Janečková,
NRL pro chlamydie,
SZÚ-CEM, Praha