Termín „alternativní“ je v  oblasti toxikologického testování užíván pro označení testů, které nahrazují klasické testy na pokusných zvířatech a poskytují minimálně stejně cennou informaci jako klasické, jsou rychlejší a pokud možno ekonomicky výhodnější. S tím spojovaný termín „integrovaný“ znamená sdružení více metod, většinou zcela odlišných (výpočtové, fyzikálně chemické, biologické). Takové vlastnosti mají metody analýzy QSAR.

Analýza QSAR se v moderní formě objevuje na rozhraní 50. a 60. let minulého století. Nejprve se jí chopili farmakologové a farmaceuti ve snaze ji využít pro nalezení co nejúčinnějšího léčiva, což povaha analýzy QSAR umožňuje. V 80. letech začala v jejím využívání dominovat toxikologie¹ se snahou využít predikčních vlastností modelů QSAR pro odhad velikosti toxických a nežádoucích účinků chemických látek dosud netestovaných před jejich používáním a distribucí mezi lidi a do přírody a k odhadu rizika při expozici chemickým látkám. Tak jsme se dostali k možnosti vyhovět programům chemické bezpečnosti „bez myší“ a k „analytické chemii bez zkumavek“ – k predikční toxikologii.

Stanovení pomocí oligochaeta Tubifex tubifex² umožňuje získat velmi rychle (3 minutový test) a levně (koupí se cestou do laboratoře v prodejně akvaristiky stále za pár korun) spolehlivé údaje o EC50 pro inhibici pohybu nitěnek. Tyto údaje korelují s údaji, které se naměří v dlouhodobějších pokusech např. s prvoky, ale i na rybách. A údajů se získá velké množství, což umožňuje zpracování do kvalitních modelů QSAR. Termíny „experimentální toxikologie“ a „metody in silico, stanovení výpočtem“, nejsou tak v takovém rozporu, jak by se mohly zdát. Metody in silico, v první řadě analýza QSAR, patří mezi alternativní metody, které stejně jako metody experimentální toxikologie pomáhají identifikovat nebezpečnost (hazard) látek, tedy jejich toxické a nežádoucí účinky.

Něco z historie

Přesto, že ještě v 60.letech minulého století nebyla koncepce QSAR příliš přijímána, badatelé ze skotské edinburgské skupiny, významný chemik Crum-Brown a jeden ze zakladatelů moderní farmakologie Fraser, již v roce 1869 napsali: „….Nemůže být žádná rozumná námitka proti tomu, že existuje vztah mezi fysiologickým účinkem látky a jejím chemickým složením a konstitucí…“. Svůj článek příhodně nazvali „On the Connection between Chemical Constitution and Physiological Action“³. Toto téma bylo náplní jedné ze dvou slavných přednášek⁴, které Sir Frazer přednesl (ve svých 31 letech) na Royal College of Physicians of Edinburgh v roce 1872 (podle⁵).

V roce 1893 uzavřel Richet své studie toxických účinností různých alkoholů, etherů, aldehydů a ketonů tím, že velikost jejich účinků je úměrná jejich rozpustnosti ve vodě.⁶ Nezávisle na sobě Mayer⁷ a Overton⁸ popsali, že narkotická účinnost látek koreluje s jejich rozdělovacím koeficientem mezi olej a vodu. Kritický přelom v kvantitativních studiích, které byly dosud zcela empirické, nastal prací Fergusona⁹, který použil představ termodynamiky. Konstatoval, že stejně velký účinek mají látky při stejně velkém chemickém potenciálu v místě účinku. Řadou studií¹⁰ tak dospěla analýza QSAR ke své moderní historii, která byla odstartována pracemi Zahradníka a Chvapila¹¹ a Hansche¹².

Kvantitativní vztahy struktura - účinnost

QSAR je zkratka pro kvantitativní vztahy mezi chemickou strukturou a biologickou účinností (z angl. Quantitative Structure – Activity Relationships) chemických látek (průmyslově vyráběných, nikoliv přirozeně se vyskytujících). Zkratka QSAR se stala nejrozšířenější, dnes jedině užívaná, od 1. Evropské QSAR konference v Praze v roce 1973, kdy se objevila v titulu sborníku konference¹³.

Analýza QSAR je analýza souboru experimentálních údajů o velikosti biologických a fyzikálně chemických vlastností chemických látek metodami matematické statistiky. Soubor údajů se může týkat série látek strukturně podobných – homologická série, nebo strukturně různorodých – heterogenní série. Čím větší série, tím výhodnější pro odvození QSAR modelu/rovnice. Rozsah hodnot biologických i fyzikálně chemických vlastností použitých k tvorbě modelu vymezují oblast jeho použitelnosti.

Model/rovnice QSAR vyjadřuje vztah mezi velikostí změny v biologické účinnosti a velikostí změny struktury molekuly, třeba změny substituentů (homologická série derivátů benzenu: benzen, toluen, anilin, chlorbenzen, a další), kvantitativně. Za předpokladu, že změna je vztažena ke stejné počáteční struktuře (substituent vodík), můžeme rovnici zapsat jednoduše jako (1):

BA_i = f(X_i), (1)

kde BA_i je biologická účinnost látky i, f matematická funkce (přímky, paraboly a jiné), X_i vlastnost příslušející struktuře látky. Termín účinnost v analýze QSAR znamená vždy velikost účinku.

Výsledkem analýzy může být matematická formule, případně soustava formulí a pravidel. Využije se při tom znalost  fyzikálně chemických vlastností látek, které jsou získávány mnohem jednodušeji než údaje biologické nebo je lze vypočítat. Model – rovnice – je vytvořen z experimentálních dat a tak simuluje test a testovací objekt, např. LD50 na myši po inhalační expozici. Počítač, který obsahuje modely a metody analýzy QSAR simuluje experimentální testovací objekt („myš v počítači“).

Modely QSAR jsou matematické rovnice, kde levá strana je obsazena velikostí vlastnosti biologické v log tvaru, log LD50(myš, iv, 24 hod.), pravá strana velikostí vlastností fyzikálně chemických, topologických nebo kvantově chemických indexů (obecně zvané molekulové deskriptory). Největší nesnáz modelů QSAR je skryta v použitých experimentálních údajích, jejich správnosti a dostupnosti.

To, že kvantitativní vztah mezi chemickou konstitucí látek a jejich biologickou účinností existuje lze vysvětlit znalostmi a představami molekulové biologie a fyzikální chemie. Za prvé, vlastnosti fyzikálně chemické ( relativní molekulová hmotnost, bod tání, tense par, spektra a další) i biologické (LD50 pro myš po intravenosním podání za 24 hodin, EC50 pro inhibici pohybu červů po tříminutové expozici, inhibiční koncentrace růstu prvoků IGC50 po dvoudenní expozici, a další) jsou společně dány uspořádáním elektronů v molekule, molekulovými orbitaly té které sloučeniny. Za druhé, biologická účinnost, velikost biologického účinku, je určena kritickým procesem, který je nejpomalejší a který určuje velikost účinku – koncentraci účinné látky v místě účinku. Ten může být řízen vlastnostmi molekul trojího druhu (se čtvrtou skupinou konstant, které nelze zařadit ani do jedné ze tří uvedených):

• hydrofobní („lipofilní“)
• elektronové (polární)
• sterického charakteru
• případně ostatní, výše nezařaditelné, např. kombinované z více výše zmíněných příspěvků (molární refrakce, parachor a jiné), topologické indexy a další.

Jednotlivým příspěvkům jsou přiřazovány fyzikálně chemické vlastnosti. Ty mohou být odvozeny z procesů, které s testovanými biologickými (toxickými) žádný přímý vztah mít nemusí – ale mohou. Nejužívanější fyzikálně chemickou vlastností se stal rozdělovací koeficient látek mezi n-oktanol a vodu – z toho lze usoudit, že onen kritický proces pro velikost toxického účinku je ukryt v toxikokinetických pochodech

Nejobecnější tvar QSAR rovnice představuje Hanschova rovnice (2):

log BA_i = k₁.log P_i + k₂.(log P_i)² + k₃R_i + k₄.S_i +k₅ (2)

kde BA_i je biologická účinnost látky i, log P_i je rozdělovací koeficient látky i mezi n-oktanol a vodu, R_i je konstanta simulující reaktivitu látky i, S_i je konstanta simulující stérické uspořádání molekuly látky i. Hanschova rovnice, obsahující substituentové konstanty (rovnice 3), vypadá následovně:

log BA_i = k₁.π_i + k₂.π_i² + k₃σ_i + k₄.E_s + k₅ (3)

kde π_i je Hanschova substituentová konstanta hydrofobnosti substituentu i, σ_i jeho Hammettova substituentová konstanta, E_s Taftova stérická konstanta a koeficienty k jsou čísla vycházející z regresní analýzy.

Nejčastěji model vystačí s hydrofobními konstantami (rovnice 4 a5):

log BA_i = k₁.log P_i + k₂, případně (4)

log BA_i = k₁.log P_i + k₂.(log P_i)² + k₃ (5).

Tvar Hammettovy rovnice použil k vytvoření modelu Rudolf Zahradník (αβ – rovnice) (6):

log (τ_i/τ_et) = αβ (6)

kde τ_i je velikost biologického účinku látky i, τ_et velikost biologického účinku ethyl derivátu jako referenční látky, α je konstanta zahrnující podmínky biologického testu a β je konstanta, popisující vliv alkylu.

Uvedené modely jsou v predikční toxikologii nejpoužívanější. Ve farmakologii zakořenila spíše fragmentální analýza, jež výpočtem konstant de novo (Free-Wilsonova analýza) slouží při hledání struktury molekul nových účinných léčiv. Fragmentální analýza spočívá v představě, že každý fragment molekuly přispívá určitou, vždy stejnou, velikostí biologického účinku do biologické účinnosti celé molekuly (rovnice 7):

BA_i = a_n + µ (n = 1, 2, 3,…) (7)

kde a_n jsou příspěvky fragmentů molekuly a µ je biologická účinnost té části molekuly, která se nemění. O předpokladu aditivity těchto příspěvků se vedou diskuse.

Metody nebo techniky analýzy QSAR jsou obvyklé i méně obvyklé metody matematické analýzy: regresní analýza s jedním nebo více parametry, lineární i nelineární, faktorová analýza, analýza hlavní komponenty, shluková analýza, rozpoznávání obrazců (pattern recognition), diskriminantová analýza, umělá neuronová síť, kybernetické techniky jako je metoda učícího se stroje, genetický algoritmus a jiné

Statistické hodnocení modelů QSAR je nedílnou součástí modelů. Korelační rovnici musí vždy doprovázet údaj o počtu párů (biologický účinek a fyzikálně chemická vlastnost) použitých dat, tj.počet látek v sérii (n), korelační koeficient (r), standardní odchylka odhadnutých dat (SD), případně F-testy a t-testy. Modely QSAR pro legislativní účely musí doprovázet další statistické údaje o dobré shodě, prediktivitě, reprodukovatelnosti^14,15.

Samostatnou kapitolu tvoří extrapolace toxických indexů mezi různými biologickými testy¹⁶ (QAAR – Quantitative Activity – Activity Relationships, případně QTTR – Quantitative Toxicity – Toxicity Relationships, kvantitativní vztahy mezi dvěma různými toxickými indexy, stanovené na různých testovacích objektech, dvěma aktivitami – účinnostmi, např. extrapolace EC50 pro rybu z EC50 na nitěnkách pomocí matematické formule). K tomuto stále živému problému přispívá analýza QSAR: vysoký, nejméně 85%, podíl modelů QSAR vystačí s logaritmem rozdělovacího koeficientu látek mezi n-oktanol a vodu jako molekulovým deskriptorem. To znamená, že pravá část jejich rovnice obsahuje stejnou nezávisle proměnnou x – log P, a to umožňuje vzájemnou korelaci levých stran y – log biologické účinnosti. Vztah pro vzájemný přepočet toxických indexů lze i vypočítat. Ten je formálně matematický, nemá nic společného s podobností mechanismů (i když může).

Kombinace modelů QSAR s modely ADME (Absorption, Distribution, Metobolism, Excretion) se stává výzkumně zajímavá i komerčně výhodná. Modely ADME simulují kinetiku procesů v organismu, které zodpovídají za koncentraci účinné látky na místě účinku, tedy absorpci (A), distribuci (D),metabolismus (M) a exkreci (E). Modely pro různé organismy a různé způsoby expozice jsou rozlišeny fyziologickými parametry organismů. Jako expertní programy pro odhad i kvality toxického účinku výpočtem, jsou označovány soubory pravidel, znalostí, údajů o toxických indexech, statistického hodnocení, výpočetních programů molekulových deskriptorů a metod matematické statistiky.

Programy chemické bezpečnosti a QSAR

Světově prosazovaný REACH je chemická legislativa, kterou předložila Evropská Unie v roce 2003, schválil Evropský parlament s účinností od 1. června 2007 a převzaly ostatní státy a je zkratkou z anglického Registration, Evaluation, Authorisation (and restriction) of Chemicals. Program má zajistit, aby nejpozději do roku 2020 byly používány pouze chemické látky se známými vlastnostmi a způsobem, který nepoškozuje životní prostředí a zdraví člověka. Záměrem těchto programů je prevence a snížení vlivu chemických látek a jejich směsí na zdraví lidí i na stav životního prostředí.

Další cíl je snížení počtu obratlovců, kteří jsou nutní pro testování toxicity chemických látek. To ale tvoří nedílnou součást ochrany přírody, tedy i lidí, před toxickými a nežádoucími účinky chemických látek a chemických přípravků. Důsledkem rozhodnutí o programech chemické bezpečnosti jsou tedy zvýšené informační, ekonomické, ale i etické požadavky. A těm všem analýza QSAR vyhovuje. Pro uspokojení požadavků programu REACH neexistuje dnes žádná jiná, dostatečně vyvinutá a prověřená metoda.

Hledají se kritéria modelů QSAR, aby výsledky, které umožňují získat, byly použitelné pro legislativní účely místo klasických, prověřených metod (in vitro i in vivo). Probíhají jednání na úrovni světových a světově uznávaných organizací (OECD, EU, EPA US)¹⁷. Některé státy již dnes analýzu QSAR a její modely pro legislativní účely úspěšně a bez obtíží používají.

LITERATURA

1. Tichy M. (red.): QSAR in Toxicology and Xenobiochemistry. Pharmacochemistry Library Vol. 8, Elsevier, Amsterdam, New York (1985)
2. Tichý M., Rucki M., Hanzlíková I., Roth Z.: ATLA–Altern. Lab. Anim. 35, 229 (2007)
3. Crum-Brown A., Fraser T. R.: Trans. Roy.Soc. (Edinburg) 25, 693 (1868-1869)
4. Frazer T. R.: Brit. Med. J. ii, 457 (1872)
5. Gaddum J. H.: Ann. Rev. Pharmacol. 2, 1 (1962)
6. Richet M.C.: C. R. Soc. Biol. 45, 775 (1893)
7. Mayer H.: Arch. Expt. Pathol. Pharmakol. 42, 109 (1899)
8. Overton E.: Studien über die Narkose. Fischer, Jena 1901
9. Ferguson J.: Proc. Roy. Soc., Ser. B 127, 387 (1939)
10. Waisser K.: Chem. Listy 92, 867-869 (1998).
11. Zahradník R., Chvapil M.: Experientia 16, 511 (1960)
12. Hansch C., Maloney P. P., Fujita T., Muir R. M.: Nature 194, 178 (1962)
13. Tichý M. (red.): Quantitative Structure-Activity Relationships. Sborník 1. European QSAR Symposium, Praha 1973. Experientia Suppl. 23, Akadémia Kiadó, Budapest, Birkhäuser Verlag, Basel, Stuttgart (1976)
14. Jaworska J. S., Comber M., Auer C., Van Leeuwen C. J.: Environ. Health Persp. 111, 1358 (2003)
15. Eriksson L., Jaworska J., Worth A. P., Cronin M. T. D.,Mc Dowell R.M., Gramatica P.: Environ. Health Persp. 111, 1361 (2003)
16. Tichý M., Trčka V., Roth Z., Krivucová M.: Environ. Health Persp. 81, 321 (1985)
17. Tichý M., Roth Z., Bláha K., Worth A. P.: Chem. Listy 99, 675 (2005)