Tento příspěvek je určen pro laboratoře hygienické služby, vyšetřující pitnou vodu v rámci monitoringu, BHD či jiného šetření. Je třeba, aby měly k dispozici v předstihu novou metodu na stanovení C. perfringens, požadavky na přístroje, zařízení, média a chemikálie a ev. mohly si i metodu předem zaběhnout v laboratoři.

Specifikace jednotlivých stanovení pro mikrobiologické ukazatele jakosti pitné vody je dána Směrnici rady 98/83/EC a bude promítnuta do Vyhlášky MZ ČR, kterou se stanoví požadavky na jakost pitné vody a limity mikrobiologických, biologických, fyzikálních a chemických ukazatelů.

Pro stanovení Clostridium perfringens (včetně spór) je určena metoda s m-CP agarem. Ta je principiálně odlišná od metody stanovení spór siřičitany redukujících anaerobů (klostridií) dle ČSN EN 26461-2. Tato metoda stanoví jen spóry, ne vegetativní buňky, protože je v metodice zařazen krok inaktivace při 75°C 15 min. a dále je použito jiné selektivní médium.

Princip stanovení:
Clostridium perfringens stanovíme technikou membránové filtrace na selektivním médiu (m-CP agar) bez inaktivace vzorku při 75°C, t.j. stanoví se vegetativní buňky i spóry. Pro potvrzení charakteristických kolonií je zařazen konfirmační test pro důkaz pozitivní kyselé fosfatázy.

Kultivační média a chemikálie:

1.selektivní médium m-CP agar:
složení:
základní médium:

příprava:
Rozpustíme složky základního média, upravíme pH na 7,6 a pak sterilizujeme při 121°C po dobu 15 min., necháme vychladnout a přidáme následující složky:

2. chemikálie pro konfirmační test:
amoniak - vodný roztok, koncentrovaný (cca 24-28 %)

Přístroje, zařízení:
zařízení pro membránovou filtraci inkubátor na 44±l°C anaerostat (zařízení na udržování anaerobní atmosféry) membránové filtry s póry 0,2 mm sklo (Petriho misky, baňky, pipety 10 ml dělené po 0,1; odměrné válce) exikátor nebo hermeticky uzavíratelný box

Postup stanovení:
Membránovou filtrací s použitím filtrů 0,2 µm filtrujeme daný objem vody, inkubaci provádíme na selektivním m-CP agaru v inkubátoru při 44±1°C po dobu 21±3 hod. za anaerobních podmínek.

Počítáme matné, neprůhledné žluté kolonie, které potvrdíme konfirmačním testem. Charakteristické kolonie (žluté) vystavíme parám amoniaku po dobu 20-30 sec. Ty, které změní barvu do růžova nebo červena jsou potvrzené kolonie.

Poznámka:
1. Konfirmační test na průkaz C. perfringens na m-CP agaru je pro mikrobiologická pracoviště poněkud netradiční. Aby se vyloučil vliv plynného amoniaku na operátory je třeba použít hermeticky uzavřený box nebo exikátor, do něhož vložíme kádinku s roztokem amoniaku a s tímto manipulujeme v digestoři nebo laminárním boxu.
2. Kompletní médium m-CP agar lze v současné době již obdržet distributory bakteriologických médií.

Kontrolní kmeny:
Kontrolní kmeny pro testování bakteriologických půd viz "Doporučené kontrolní kmeny pro testování médií" - Masarykova Univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta, Česká sbírka mikroorganismů (CCM), Brno, Tvrdého 14, 602 00 Brno.

m-CP agar:
pozitivní kontrola - CCM 4435 Clostridium perfrigens
negativní kontrola - CCM 1999 Bacillus subtilis

publikováno v březnu 2001 - revidováno  v květnu 2004